[发明专利]提高BRAF基因V600E突变的诊断效率的方法

说明书

本发明涉及提高BRAF基因V600E突变的诊断效率的方法。本发明人优化了检测BRAF基因V600E位点突变的检测试剂，在此基础上提供了检测BRAF基因V600E位点突变的试剂盒、用途及检测方法。

技术领域

本发明属于诊断领域，更具体地，本发明涉及提高BRAF基因V600E突变的诊断效率的方法。

背景技术

BRAF基因又称鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1基因，是人类最重要的原癌基因之一，主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中。

BRAF基因突变绝大多数集中在第15号外显子第1799位碱基(TA)，导致编码的氨基酸变化(V600E)。该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，驱动肿瘤细胞的生长增殖和侵袭转移。BRAF基因V600E突变检测可用于指导黑色素瘤患者BRAF激酶抑制剂的使用和结直肠癌EGFR抗体的靶向治疗，还可作为结直肠癌和甲状腺癌患者辅助诊断和病情预后的一项重要指标。

目前常用的BRAF V600E突变检测方法有测序法和ARMS-PCR法。测序法灵敏度较低约20％，且操作复杂，检测时间较长。ARMS-PCR法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，需有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3’则导致PCR不能延伸。ARMS-PCR方法能够达到1％的灵敏度，对于突变比例较高的肿瘤组织样本尚能够满足检测需求，但是对于突变含量低的组织样本，尤其是取材方便的液态活检样本，如血液、尿液和唾液样本，难以有效检测。另外，有研究表明，基因敏感突变的比例与靶向药物疗效关系密切，而测序法和ARMS-PCR方法均为定性检测，仅能提供基因有无突变的信息，无法给出肿瘤突变的比例，不足以判断突变弱阳性患者是否能受益于靶向治疗。

因此，本领域需要开发改进的或新的BRAF V600E突变检测方法，来改变上述现有技术中存在的现状。

发明内容

本发明的目的在于提供提高BRAF基因V600E突变的诊断效率的方法。

在本发明的第一方面，提供一种检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)扩增BRAF基因V600E突变位点区域的特异性前引物和后引物，所述的特异性前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～150bp(较佳地为50-100bp；例如55，60bp，70bp，80bp)；所述特异性前引物与突变型基因位点及邻近序列完全互补；较佳地，其3’末端碱基与BRAF基因V600E突变位点碱基互补；或

扩增BRAF基因V600E突变位点区域的前引物和特异性后引物，所述的前引物和特异性后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～150bp(较佳地为50-100bp；例如55，60bp，70bp，80bp)；所述特异性后引物与突变型基因位点及邻近序列完全互补；较佳地，其3’末端碱基与BRAF基因V600E突变位点碱基互补。

(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。

在一个优选例中，所述的可检测标记是荧光标记。

在另一优选例中，所述的BRAF基因V600E突变为：BRAF基因的第15号外显子第1799位碱基发生TA的突变。

在另一优选例中，所述的特异性前引物的长度为10-25bp；较佳地为12-20bp；或所述的特异性后引物的长度为10-25bp；较佳地为12-20bp。