[发明专利]一种亚型Ph‑likeALL的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种亚型Ph-likeALL的检测方法。

背景技术

急性淋巴细胞白血病（简称ALL）是儿童最常见的肿瘤，发病率随年龄的增长而降低，目前重现性染色体改变是ALL的重要标志，包括染色体重组、结构改变等。多年来，临床通过结合上述染色体变异特征，对ALL进行危险分层治疗，使得ALL的治疗效果得到了很大得改善，其中儿童ALL 的5年生存率提高到了85%，然而仍有部分患者治疗预后差，ALL的复发难治性使得该病依然是儿童及成人主要的致死疾病之一。

Ph-likeALL，是根据基因表达谱鉴定的一组疾病，其基因表达谱与BCR-ABL1阳性ALL相似，但不表达BCR-ABL1，所以称之为BCR-ABL1-like ALL，又称为Ph-likeALL。此类ALL主要见于急性前体B细胞淋巴细胞白血病（BCP- ALL），一般缺少BCP-ALL中典型的基因及染色体变异（ETV6-RUNX1、E2A-PBX1、ERG和MLL重排、超二倍体等）且经常会伴有高风险临床特征。研究发现，Ph-likeALL约占SR（标危）和HR（高危）儿童B-ALL的15%，在青年ALL中约为27.4%。与BCR-ABL1阳性ALL相似，Ph-likeALL患者预后差，常规化疗效果不佳，易复发。细胞株和人类白血病细胞表达的ABL1， ABL2， CSF1R和PDGFRB融合基因在体外对达沙替尼（dasatinib）敏感，EPOR 和JAK2对磷酸鲁索替尼（ruxolitinib）敏感，ETV6–NTRK3融合基因对克唑替尼（crizotinib）敏感。上述药物仅针对个别异常的融合基因起到抑制作用，使用有一定的局限性；在检测或者细胞过程时，需要多种药物多次检测，操作繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺陷，提供一种亚型Ph-likeALL的检测方法，能够简单快速全面地检测Ph-likeALL。

本发明的技术方案是：一种亚型Ph-likeALL的检测方法，包括下列步骤：

1）分别配制乙醇溶液、预处理液、洗液和酶缓冲液，置2℃-8℃氮气条件储存；

2）荧光探针溶解：向探针管内加10~20μl水，加入150~200μl杂交液，超声溶解30~60s，得到探针溶液；

3）将骨髓细胞固化，涂抹于玻片上，经过预处理，制成涂片；所述固化为肝素化处理或经EDTA-醋酸钠处理；

4）将探针溶液预温到室温，漩涡混匀，离心2~3s，取5~15μl混匀的探针溶液滴加到杂交区域，盖上盖玻片，用封片胶密封；

5）设置程序：先70~80℃变性5~10分钟，然后 35~40℃杂交16~18h；

6）除去封片胶，置于考普林缸内的室温洗液中1~5min洗去盖玻片，取出涂片，用已预热至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室温65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然风干；

7）滴加复染液到杂交区域，盖上盖玻片，置-25~ -15℃暗处复染20分钟以上；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液5~7份，氯化镁1~3份，柠檬酸0.2~0.6份，荧光素0.5~0.7份，海藻酸钠0.1~0.3份；

8）使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。

具体的，所述乙醇溶液的体积分数为70~ 85%；所述预处理液为0.9~1.1mol/L的硫氰酸钠溶液；所述洗液由以下重量百分数的组分组成：氯化钠1.7~1.8%，柠檬酸钠0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量为水；所述酶缓冲液为0.009~0.011mol/L的稀盐酸。

优选地，所述荧光探针共12组，分别为ABL1，ABL2，CSF1R，PDGFRB， CRLF2，JAK2，EPOR，IL2RB，NTRK3，PTK2B，TSLP和 TYK2。

绝大部分Ph-likeALL患者有染色体重排或其他的遗传改变，可激活细胞因子受体或激酶信号。重排基因包括ABL1， ABL2， CRLF2，CSF1R， EPOR， JAK2， NTRK3，PDGFRB， PTK2B， IL2RB，TSLP或TYK2。ABL1，ABL2，CSF1R，JAK2表达和 PDGFRB融合基因导致细胞因子独立性扩增和磷酸化STAT5激活。将上述重排基因进行标记得到荧光探针，与复染液制成试剂盒。