[发明专利]一株耐高温酿酒酵母菌株及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株耐高温酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

现今，乙醇的作用在生活中随处可见，且利用酿酒酵母的优势菌种生产乙醇的发酵工艺也已十分成熟。Casey等人最早提出浓醪发酵(very high gravity fermentation)的概念，即每100g发酵液中含有大于等于18g可溶性固形物的发酵。由于提高了原料初始浓度，乙醇的最终浓度也得到大幅度的提高。另外，发酵过程中积累的乙醇能抑制杂菌的生长及代谢，使设备的利用率有效提高，减少了发酵及蒸馏过程中的能量投入，从而使发酵成本降低、利润提高，故浓醪发酵工艺受到了广泛关注。

随着浓醪发酵工艺的广泛应用，也给酿酒酵母的耐受性提出很高的要求。在浓醪发酵的初期，酵母细胞受高糖浓度(高渗透压浓度)抑制，细胞生长发育缓慢甚至停止。发酵结束时，高浓度的乙醇浓度虽在一定程度上能抑制杂菌的生长与代谢，但此时也有可能释放某种毒性物质并对酵母细胞生长产生抑制，导致酿酒酵母细胞生长缓慢或死亡，进而减弱发酵菌株的呼吸作用，降低发酵代谢水平。另外，在发酵过程中虽使用冷凝水，但冷凝水的流速不会随着发酵时间而改变，主发酵期热量产生过多，而不能被冷凝水及时带走，就可能使发酵罐罐体中发酵液温度过高，从而造成酵母细胞的存活率及发酵性能的降低。这些胁迫环境都会影响到最终的乙醇产量，因此，提高酵母菌种的耐受性，可提高菌种的发酵性能，降低发酵过程中能量消耗，从而提高生产效益和经济效益。

对酵母细胞耐受性的调节，酵母细胞环腺苷酸信号通路(Ras/cAMP/PKA)起着关键作用，该信号通路活性的改变会影响酵母细胞的耐受性。研究发现，在以葡萄糖为碳源的培养基上培养的酵母细胞，酿酒酵母的时序寿命与其压力抗性，尤其是热激抗性正相关，而与Ras/cAMP/PKA信号通路的活性负相关，即蛋白激酶A(PKA)的活性可影响细胞的生长和耐热性能，活性高的细胞生长性能好，而活性低的细胞对热胁迫耐受性好。基因SCH9编码的蛋白激酶Sch9与PKA的催化亚基具有高度同源性，PKA由催化亚基和调节亚基两部分构成，环腺苷酸(cAMP与PKA的调节亚基结合，使得PKA的催化亚基和调节亚基分开，被激活的催化亚基可以使底物磷酸化。故通过对基因SCH9进行改造，会影响PKA的活性，进而影响酵母细胞一系列的生命活动。

谭伟指出，在酵母SCH9Δ突变菌株中，葡萄糖信号水平较低，其寿命增加，抗性增强。SCH9基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶介导葡萄糖/营养信号通路，激活生长以及糖酵解、调节压力抗性、糖原积累和糖再生。通过对SCH9基因进行长引物敲除，以酵母体内固有基因URA3作为筛选标记，获得SCH9基因缺失的酿酒酵母突变株。构建的耐高温酿酒酵母突变菌株可安全用于工业生产，同时不残留外源标记基因的方法可广泛应用于酵母及其他微生物的基因改造，促进了基因精确修饰的发展。

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供一株耐高温酿酒酵母菌株及其构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的耐高温酿酒酵母菌株是对高温具有一定耐受性的酵母菌株。获得耐高温酿酒酵母菌株的出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。

所述高耐受酿酒酵母菌株在正常的生长性能不受影响的情况下，对55℃热激以及8％(v/v)乙醇都有一定的耐受性，并在38℃玉米原料高温浓醪发酵中乙醇产量相对亲本菌株提高了16.4％。

所述耐高温酿酒酵母菌株具体可以通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315出发菌株进行长引物敲除来实现。

上述基因长引物敲除可以用以下方法实现：

本研究以SCH9基因作为靶序列，以提供的酿酒酵母工业菌株为出发菌株，以酵母体内固有的URA3基因作为筛选标记。使用带有待敲除基因SCH9的40bp同源序列和带有URA3基因的19bp同源序列的长引物进行PCR扩增得到带有同源臂的片段，将重组片段利用醋酸锂转化法导入到感受态酿酒酵母细胞中，通过与酵母染色体上的同源序列发生重组，经抗性板筛选出转化子，通过PCR全长验证得到AY12a-SCH9Δ突变菌株，即URA3基因替代了酵母染色体上的SCH9基因，从而实现了SCH9基因的敲除。将AY12a-SCH9Δ与AY12α进行回交融合，然后再生孢分离单倍体，即获得新的AY12a-SCH9Δ突变株及AY12α-SCH9Δ突变株。