[发明专利]一种基于质谱的N-糖链相对定量的方法

说明书

本发明属生化分析技术领域，涉及一种基于质谱的N‑糖链相对定量的方法，本方法利用苯胺功能化的大环化合物标记N‑糖链再螯合稀土金属离子相对定量，其中采用苯胺功能化的DOTA对N‑糖链衍生，在螯合稀土金属离子Ho³⁺/Lu³⁺，两步反应均具有较高的衍生效率；测试结果显示，通过衍生上螯合了稀土金属离子的DOTA后，能提高糖链在MALDI‑MS负离子反射模式下的离子化效率，并改善糖链在质谱中的碎裂，有助于糖链结构解析。本发明用于大肠癌病人与正常人血清中N‑糖链表达水平的差异分析结果显示，本方法通过螯合不同的稀土金属离子，能实现多标标记定量，并具有很好的定量准确性及重复性。

技术领域

本发明属生化分析技术领域，涉及N-糖组学分析，具体涉及一种基于质谱的N-糖链相对定量的方法，尤其涉及一种利用苯胺功能化的大环化合物标记N-糖链再螯合稀土金属离子的相对定量新方法。本方法通过衍生上螯合了稀土金属离子的DOTA后，能提高糖链在MALDI-MS负离子反射模式下的离子化效率，并改善糖链在质谱中的碎裂，有助于糖链结构解析；通过螯合不同的稀土金属离子，能实现多标标记定量，并具有很好的定量准确性及重复性。

背景技术

现有技术公开了N-糖基化是生物体内最普遍存在的一种翻译后修饰，在诸多生命过程中起着重要的作用，如蛋白质的折叠，细胞-细胞相互作用，细胞识别以及炎症反应等。研究表明，异常的糖基化与许多重大疾病，如免疫缺陷，老年痴呆症及癌症等息息相关。研究报道，N-糖链有可能成为癌症的血清标志物，因此，解析N-糖链结构并进一步定量分析是深入了解N-糖链在生物过程所扮演角色的必要前提，然而，实践显示，所述的研究面临着巨大的困难，首先，含糖基化修饰的蛋白种类虽然很多，但是其丰度很低，第二，由于N-糖链是非模板合成，具有微观不均一性，且离子化效率低，在质谱解析上仍存在着诸多瓶颈，第三，尽管已经有较多的方法实现了N-糖链的定量，如代谢标记，¹⁸O标记，化学标记等，但该些定量方法仍存在下述缺陷，均为基于同位素²D,¹³C,¹⁵N和¹⁸O的标记实现质量差标签的引入，等。基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种基于稀土金属离子螯合标记的伪同位素标记方法，尤其涉及一种利用苯胺功能化的大环化合物标记N-糖链再螯合稀土金属离子的相对定量新方法；通过苯胺功能化的DOTA(S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)标记N-糖链的还原端，再螯合不同的稀土金属离子，使能够同时实现N-糖链的结构解析及相对定量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种基于质谱的N-糖链相对定量的方法，具体涉及一种利用苯胺功能化的大环化合物标记N-糖链再螯合稀土金属离子的相对定量新方法。尤其是一种利用苯胺功能化的DOTA标记N-糖链还原端再螯合稀土金属离子Ho³⁺/Lu³⁺实现相对定量的方法。本方法有助于N-糖链结构解析并实现N-糖链相对定量。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

1.以麦芽七糖DP7为标准样品，考察苯胺功能化的DOTA与糖链的衍生效率；

2.考察苯胺功能化的DOTA螯合稀土金属离子Ho³⁺/Lu³⁺的衍生效率；

3.以麦芽七糖DP7为标准样品，考察DOTA螯合稀土金属离子Ho³⁺/Lu³⁺标记糖链用于糖链相对定量的可行性；

4.以核糖核酸酶B(RNB)、去唾液酸胎球蛋白(ASF)、鸡卵清白蛋白(OVA)、牛血清胎球蛋白(Fetuin)为标准糖蛋白，测试DOTA螯合稀土金属离子Ho³⁺/Lu³⁺标记N-糖链用于N-糖链相对定量的可行性；