[发明专利]一种利用含血清培养液体外构建的3D模型及其构建方法

说明书

本发明公开一种利用含血清培养体系在体外构建的3D模型及其构建方法，涉及组织工程学生物材料技术领域，由于该3D模型的种子细胞选择多样，体外构建重复性佳，可实现产业化制备；同时，使用含血清培养体系，提供细胞所需营养的同时，减少了因子的添加。该模型是应用细胞生物学和工程学原理，使用组织分离的原代角膜上皮细胞，或角膜缘干细胞，或永生化角膜上皮细胞，或原代口腔黏膜上皮细胞，或口腔黏膜鳞状癌细胞株TR146，经体外扩增后，采用含血清培养液，及液下‑气液面分段培养法，使其复层化，形成体外3D模型。

技术领域

本发明属于组织工程学生物材料技术领域，具体涉及一种利用含血清培养体系在体外构建的3D模型及其构建方法。

背景技术

本发明中3D模型是应用细胞生物学和工程学原理，将少量种子细胞经体外扩增后构建而成，其结构与正常人角膜上皮结构高度类似，由下而上的结构依次为基底层、棘层、颗粒层、棘层，均无角质层，具有完整的上皮结构，且表达角膜相关角蛋白。该体外构建的3D模型主要用作眼刺激体外检测，对小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、化妆品等产品的安全性进行评价。

化学物直接接触或者暴露于眼部，会引发刺激性以及局部毒性。因此，眼表刺激性风险评估是危害评价以及风险规避程序中非常需要的一项。传统方法中对新型化合物的眼刺激潜在风险的评估主要依赖于体外的兔眼实验，这种方法耗时耗力、且成本较高。因此，寻找快速、经济的化合物筛选方法成为该领域的一项迫切需求，并激发了大量的关于眼表刺激性风险评估的体外替代方法的建立的相关工作的开展，例如牛角膜不透明度及渗透性检测，鸡胚尿囊膜实验等，上述技术通过一定程度的组合可以实现体外眼刺激性评价，但却都无法完全实现体外兔眼刺激实验的替代。近年来，随着体外器官培养技术的发展，基于体外细胞培养构建的3D重组角膜上皮模型，在眼刺激风险评价领域表现出特有的趋势。体外构建的3D角膜上皮模型，类似于人体角膜上皮的三维结构，其不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应，准确给出化学物刺激性的预测，对于化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴，除了不同功效目的的剂型开发，也包括化妆品具体成分的危害评价。目前，采用体外构建3D重组角膜模型进行的眼刺激性检测已被国际认可，2015年OECD指南492即给出了采用该模型的一种替代方法。

目前，国际上主要有三种商业化的体外重组角膜上皮模型，第一款EpiOcular™(MatTek, MA, USA)，HCE (Skin Ethic, France)以及CORNEA-MODEL（Labcyte，Japen）。其中，MatTek的EpiOcular^TM以人源的表皮角质化细胞作为种子细胞，体外培养形成类似于角膜上皮结构的模型，虽然该模型在眼刺激性动物替代评价方法中扮演着重要的角色，但非角膜细胞系并不能完全等同于人角膜。Labcyte的CORNEA-MODEL采用正常的人角膜上皮细胞系进行构建，体外培养形成角膜上皮结构；角膜上皮细胞是体外研究细胞分化、信号传导、细胞稳态信号通路的模式工具，也可以用来构建体外三维的角膜上皮组织模型，但是，可用角膜组织的有限来源，加之角膜细胞自身短暂的生命周期以及快速的分化，使得角膜上皮细胞体外培养难度大，且非常耗时。许多尝试增长角膜上皮细胞体外培养周期的工作都有开展，例如病毒转染，端粒酶逆转录基因转染等，Skin Ethic的HCE模型采用永生化的角膜上皮细胞系作为种子细胞进行培养，形成多细胞层的角膜上皮组织类似物，其结构上和角膜黏膜非常类似。

中国专利201410062366申请公开了一种简易角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒及方法，采用该方法进行角膜缘干细胞分离和体外培养，操作简单，干细胞得率高，所得原代干细胞损伤少，增值能力强，体外培养成功率高，重现性好。

中国专利03150375.6申请公开了一种组织工程自体角膜上皮及其制备方法，该方法将来源于患者自体的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞在体外扩增和分化后，接种到纤维蛋白生物支架上进行培养，在体外构建组织工程自体角膜上皮。