[发明专利]一种利用含血清培养液体外构建的3D模型及其构建方法

权利要求书

1.一种利用含血清培养液体外构建3D模型的体外构建方法，其特征在于，所述利用含血清培养液体外构建3D模型的体外构建方法包括以下方法步骤：

步骤一、细胞的准备

取原代角膜上皮细胞，或角膜缘干细胞，或永生化角膜上皮细胞，或原代口腔黏膜上皮细胞，或口腔黏膜鳞状癌细胞株TR146，复苏扩增后，使用P4～P20代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×10⁴个/mL～5.0×10⁶个/mL，接种于培养瓶中，加含5％～20％胎牛血清的培养液Ⅰ培养，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5％CO₂条件下培养；

所述培养液Ⅰ，为DMEM，其所含葡萄糖含量为1.0～4.5g/L，谷氨酰胺含量为0.2g/L～20.0g/L；

步骤二、3D模型的液下接种培养

取对数生长期细胞，以培养液Ⅱ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×10⁴个/mL～5.0×10⁶个/mL，以200μL/室的体积，接种于小室内，将小室置于模型培养皿内，每皿添加适量培养液Ⅱ，使小室内外液面高度一致，进行浸没式培养；置于37℃、5％CO₂条件下培养0.5～2小时，后转入液下培养，培养时间为1～3天，每天换液；

所述培养液Ⅱ，是以DMEM：F12含量为3:1～1:3的培养基为基础培养基，添加胎牛血清浓度为5％～20％，维甲酸浓度为4～10μg/mL，人表皮生长因子浓度为0.1～10.0ng/mL，胰岛素浓度为5.0～50.0ng/mL，氢化可的松浓度为0.1～5.0μg/mL，腺嘌呤浓度为5.0～50.0μg/mL，三碘甲状腺氨酸浓度为0.1～10.0μg/mL，透明质酸浓度为0.01％～0.1％，黄酮浓度为5.0～50.0μg/mL，谷氨酰胺浓度为0.2g/L～20.0g/L，霍乱毒素浓度为1.0～100.0μg/L，二性霉素B浓度为1.0～10.0mg/L，青霉素浓度为10.0～100.0IU/mL，链霉素浓度为10.0～100.0μg/mL；

步骤三、3D模型的气液面增殖分化培养

将上述小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液Ⅲ，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1～7天，每天换液，培养结束，模型的体外构建结束；

所述培养液Ⅲ，为在培养液Ⅱ中，增加氢化可的松浓度为5.0～10.0μg/mL，透明质酸浓度为0.1％～1％，黄酮浓度为50.0～150.0μg/mL，并添加维生素E浓度为20.0～80.0μg/mL。

2.根据权利要求1所述的利用含血清培养液体外构建3D模型的体外构建方法，其特征在于，所述模型构建时间为3～10天。

3.根据权利要求1或2所述的利用含血清培养液体外构建3D模型的体外构建方法，其特征在于，使用ET50法检测所述利用含血清培养液体外构建3D模型的屏障功能，在液下培养结束后，其ET50是0.3％TritonX-100使模型内半数细胞死亡所需的时间，为5～15min。

4.根据权利要求1或2所述的利用含血清培养液体外构建3D模型的体外构建方法，其特征在于，使用ET50法检测所述利用含血清培养液体外构建3D模型的屏障功能，在气液面培养结束后，其ET50为30～70min。

5.根据权利要求1或2所述的利用含血清培养液体外构建3D模型的体外构建方法，其特征在于，所述模型应用于小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、化妆品等产品的眼刺激性体外检测。

6.一种根据权利要求1～5所述的方法构建的3D模型。