[发明专利]一种黑素细胞均匀生长的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种黑素细胞均匀生长的培养方法。

背景技术

随着体外检测的发展，3D皮肤模型已经成为了体外检测的主要研究工具。目前市场上已经有EpiDerm (MatTek Corporation)和EPISKIN (EPISKIN SNC)已经完成正式的体外皮肤刺激性检测验证，并纳入OECD TG 439指南。并且随着市场的需要，不同类型的皮肤模型也被开发，例如：含黑素的表皮皮肤模型，双层皮肤模型等。

美白祛斑化妆品是化妆品研究中的重要方向之一。目前对于美白化妆品的安全以及功效评价都是基于动物模型如豚鼠进行验证，但是随着欧盟对动物实验的严令禁止，美白化妆品的安全与功效评价成为的化妆品上市前的一大难题。如果有一款黑素皮肤模型的认证成功就可以解决美白化妆品的上市难题。但是黑色素细胞仅占表皮细胞数量的1％左右，而且其贴壁能力差，生长缓慢，增殖能力极为有限，容易聚集，所以提高黑素细胞的贴壁能力以及降低聚集能力是黑色素细胞培养的重点，同时也解决了黑素模型构建过程中的肤色不均的难题。

现有技术中，促进黑色素细胞生长主要是在黑素细胞的培养液中添加一定浓度的TPA(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)和霍乱毒素。但是TPA具有潜在的致癌作用，从而使上述培养方法在临床上受到了限制。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和二丁酰环腺苷酸（dcAMP）作为添加剂替代TPA进行原代培养则解决了上述技术问题，该技术可以使促进黑色素细胞生长，并且规避了TPA具有潜在的致癌的风险。黑素细胞一般在24h才能够完全贴壁，而目前解决的黑素细胞的贴壁方式主要是采用预培养的方式，在接种或是共培养前，将黑素细胞预培养5h～10h，然后在接种其他细胞构建模型或是细胞膜片用于体外检测以及临床。这样的技术虽然解决了黑素细胞的贴壁问题，但是时间过长导致成本增高。

从黑素皮肤模型的研究现状可以看出，黑素皮肤模型的表观有的呈现黑素颗粒的点状聚集，有的呈现黑素的片状聚集。因此对于黑素皮肤模型的黑素细胞的快速贴壁以解决黑素细胞在载体上的均匀分布是解决模型构建中黑色素聚集的关键问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种黑素细胞均匀生长的培养方法。该方法既可以保证黑素细胞的活性，又能使黑素细胞快速贴壁并能均匀生长，采用该方法培养的黑素细胞贴壁率提高了25%～40%。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、收集黑素细胞，用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；

步骤二、用多聚赖氨酸溶液对培养小室底膜进行过夜包被处理，然后将包被处理后的培养小室置于孔板中，每个小室底膜滴加200μL多聚赖氨酸溶液进行包被，最后将孔板封闭，于37℃培养箱过夜，得到预处理的培养板；

步骤三、将步骤一中培养收集的黑素细胞制成细胞悬液加入步骤二中预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于CO₂培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为5%～10%，胎牛血清的体积百分含量为5%～15%，L-谷氨酰胺的浓度为6mM～15mM，霍乱毒素的浓度为0.2g/mL～0.8g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为3nmol/L～13nmol/L，氯化钙的浓度为4mM～10mM；

步骤四、将步骤三中取出的培养板中的培养液更换成增殖培养液，于CO₂培养箱中增殖培养24h～48h；所述增殖培养液以M254液体培养基为基础液，添加黑素细胞生长添加因子HMGS和胎牛血清，增殖培养液中黑素细胞生长添加因子HMGS的体积百分含量为0.5%～5%，胎牛血清的体积百分含量为5%～15%。

上述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤一中收集黑素细胞的方法具体为：用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪后用Dispase消化液消化16h～20h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化5min～15min；最后用无菌的200目筛网收集黑素细胞。