[发明专利]一种黑素细胞均匀生长的培养方法

权利要求书

1.一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、收集黑素细胞，用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；

步骤二、用多聚赖氨酸溶液对培养小室底膜进行过夜包被处理，然后将包被处理后的培养小室置于孔板中，每个小室底膜滴加200μL多聚赖氨酸溶液进行包被，最后将孔板封闭，于37℃培养箱过夜，得到预处理的培养板；

步骤三、将步骤一中培养收集的黑素细胞制成细胞悬液加入步骤二中预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于CO₂培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为5%～10%，胎牛血清的体积百分含量为5%～15%，L-谷氨酰胺的浓度为6mM～15mM，霍乱毒素的浓度为0.2g/mL～0.8g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为3nmol/L～13nmol/L，氯化钙的浓度为4mM～10mM；

步骤四、将步骤三中取出的培养板中的培养液更换成增殖培养液，于CO₂培养箱中增殖培养24h～48h；所述增殖培养液以M254液体培养基为基础液，添加黑素细胞生长添加因子HMGS和胎牛血清，增殖培养液中黑素细胞生长添加因子HMGS的体积百分含量为0.5%～5%，胎牛血清的体积百分含量为5%～15%。

2.根据权利要求1所述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤一中收集黑素细胞的方法具体为：用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪后用Dispase消化液消化16h～20h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化5min～15min；最后用无菌的200目筛网收集黑素细胞。

3.根据权利要求1所述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤二中所述多聚赖氨酸溶液的浓度为25μg/mL～75μg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤三中所述黑素细胞预培养液的pH值为8～10。

5.根据权利要求1所述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤四中所述增殖培养液的pH值为7.2～7.4。