[发明专利]一种表皮细胞大规模培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种表皮细胞大规模培养方法。

背景技术

表皮细胞是生物医学和组织工程领域常用的原材料和研究工具，其中药品和化妆品开发中原料的筛选、效价的评估、安全性评价等均涉及到表皮细胞的应用。例如，在组织工程领域各种组织工程体外检测皮肤模型的构建，用于烧烫伤等疾病治疗的组织工程皮肤的构建，细胞膜片的培养等。以上应用均需大量状态一致性好，细胞纯度高，质量稳定的表皮细胞。

目前针对表皮细胞的大规模培养方法鲜有报道，细胞的大规模培养首先应防止污染，获得足够数量细胞，保证细胞质量稳定、状态一致是得到可靠实验数据和产品的前提。目前传统细胞培养方法有以下几种：

（1）微载体培养方式：需采用反应器等成套设备，成本高，建设周期长，不利于放大，由实验室瓶养转大规模生产操作过程复杂，技术要求高，参数确定时间长。

（2）采用滋养层培养：在细胞获取过程中难免混入较多杂细胞，无法得到纯度高的表皮细胞，不能用于针对性研究，大规模生产中各种细胞混杂，细胞比例不一致，无法得到某种细胞的明确数量。在采用丝裂霉素处理抑制滋养层细胞增殖过程中，由于该抑制作用无选择性，故残留丝裂霉素对增殖同样会有影响；若采用辐照，剂量波动无法精确控制，如果致死的Fb数量不够或过量，会直接影响表皮细胞生长所需的营养成分、因子浓度，表皮细胞有接触抑制特性，若滋养层细胞过量增殖，直接影响表皮细胞的获取数量，而且，辐照过程的无菌难以保证；活细胞在辐照时一般单位无法满足时效性要求。例如，在中国专利CN200910155159采用微载体加滋养层的含血清培养方法，该方法培养液成分复杂，滋养层细胞种类多，处理工艺繁琐或不易量化，血清中钙离子会明显促进表皮细胞分化。

（3）含血清培养基：血清中的钙离子是促使表皮细胞分化的一个重要因素，同时细胞分化也限制的细胞的后续扩增次数。例如，在中国专利CN201610 364492中主要是通过培养基的开发来降低成本，从而使大规模培养从成本考虑角度变得可行，但未涉及具体细胞质量提高或状态稳定或纯度方面内容。

按照上述传统培养方法，在大规模培养中接种密度太低，细胞很难存活，也难以获得质量稳定、状态一致性好、纯度高的表皮细胞。

发明内容

为了解决上述缺陷，本发明能够提供一种表皮细胞大规模培养方法，可短时间内在体外获得大量质量稳定、状态一致性好、纯度高的表皮细胞，解决了现有技术难以在大规模的获取状态一致性好、纯度高的表皮细胞的问题。

本发明所采用的技术方案是，集约化的细胞体外培养方式，通过控制接种密度、培养液加入量、增加气体强制交换、改变细胞消化方式等，为细胞提供离体培养所需的pH、渗透压、营养物质、调节物质等，从而获得大量质量一致的细胞。该表皮细胞大规模培养方法具体包括以下步骤：

步骤1，接种

将表皮种子细胞与培养液混匀重悬后，均匀接种于细胞工厂中，保证每层接种细胞数量一致；

步骤2，培养

将接种好的表皮细胞放入CO₂培养箱，在37℃、5% CO₂浓度条件下进行培养，根据传代需求培养一段时间后收获细胞；

步骤3，消化

向细胞工厂加入消化液，CO₂培养箱37℃孵育，待大部分细胞不再贴壁时，立即将工厂内液体转移到装有终止液的容器中终止消化；然后向细胞工厂继续加入相同体积的消化液，CO₂培养箱37℃孵育至所有细胞不再贴壁时，再向细胞工厂中加入相同体积的的终止液终止消化；

步骤4，离心

收集两次终止后的所有液体，离心弃上清，用PBS平衡盐溶液重悬，再次离心弃上清，得到大规模培养好的表皮细胞。

本发明的特点还在于：