[发明专利]一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用。

背景技术

B族链球菌学名为无乳链球菌，是一种有荚膜的细菌，能够引起牛乳房炎，危害牧业非常严重，所以早为畜医界注目。后来发现该细菌能够感染人类，尤其是新生儿。该细菌所引起的败血症、脑膜炎、肺炎等疾病的死亡率极高，并且通常伴有神经系统后遗症，由此又被医学界所重视。

B族链球菌是妇女生殖道常见的携带菌，也是妇女围产期感染、泌尿道感染、新生儿菌血症、心内膜炎等主要病原菌。目前治疗B族链球菌感染多选用β内酰胺类抗生素，对有过敏体质或轻微感染患者，常用大环内酯类抗生素替代。随着大环内酯类抗生素的使用显著增加，导致大量耐药菌株出现，我国有关B族链球菌耐药性及耐药基因谱的资料少见报道。

发明内容

本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够特异性检测B族链球菌耐药基因的方法，本发明提供了一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用。

技术方案：一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。

优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。

表1分子标记序列

所述分子标记在制备检测B族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。

优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl₂、双蒸水。

优选的，所述试剂盒检测B族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的B族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10～60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；

(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；

(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。

优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

有益效果：(1)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高、稳定性好的优点；(2)本发明所述分析标记能够有效检测耐药基因，确定造成耐药的原因，了解耐药流行株的发生、发展、传播规律，对预防和控制耐药发展起着非常重要的作用。

附图说明

图1是实施例1～3检测结果图；

其中，1为分子量为2000bp的Maker；2为实施例1PCR产物电泳结果；3为实施例2PCR产物电泳结果；4为实施例3PCR产物电泳结果。

具体实施方式

实施例1

一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。

所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。

所述分子标记在制备检测B族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl₂、双蒸水。

所述试剂盒检测B族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：