[发明专利]一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用

权利要求书

1.一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测B族链球菌四环素耐药基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。

3.权利要求1或2所述分子标记在制备检测B族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl₂、双蒸水。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测B族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的B族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌EP管中加入10～60μL 60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；

(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；

(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。