[发明专利]一种改造腈水合酶及其应用

说明书

本发明公开了属于酶工程和工业微生物技术领域的一种改造腈水合酶及其应用。本发明改造腈水合酶的获得方法为：如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的α亚基的133位Pro和如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的β亚基的215位Asp分别置换为Cys，使两个亚基之间形成二硫键。本发明改造腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性都有显著提升，并且没有导致腈水合酶活性的降低。改造腈水合酶可催化获得高浓度丙烯酰胺产物，且可以多批次回用。

技术领域

本发明属于酶工程和工业微生物技术领域，具体涉及一种改造腈水合酶及其应用。

背景技术

微生物生产的腈水合酶可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。丙烯酰胺聚合产生的聚丙烯酰胺在三次采油、水处理、造纸等工业生产领域具有非常广泛的应用。利用微生物产生的腈水合酶催化生产丙烯酰胺具有一系列优点，包括反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等，因此逐渐成为丙烯酰胺生产的主要方法。

微生物法生产丙烯酰胺的研究重点在于高产腈水合酶菌株的发现和改造以及对腈水合酶本身性能的基因工程改造。其中，在基因工程方面，日本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》(申请号：93106122.9)；三井化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》(专利号：ZL99106291.4)；《新型腈水合酶》(专利号：02156180.X)，并研究了该基因在重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》(申请号：200580008206.8)；清华大学公开了“一种腈水合酶及其编码基因与应用”，构建了α亚基起始密码子突变的腈水合酶，并在大肠杆菌中高活性表达(专利号：ZL 200410042576.0)；清华大学在专利“一种腈水合酶基因簇及其应用”中公开了红色(赤)红球菌RhodococcusruberTH中与腈水合酶高表达相关的结构基因和调控基因序列(专利号：ZL200910076710.1)。

除了产物/底物耐受性外，在微生物法生产丙烯酰胺的催化水合过程中，制约生产效率的另一个主要问题就是产酶细胞的耐热性较差，水合温度必须通过低温制冷剂控制在15-22℃。由于腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺是强放热反应，工业生产中控温的冷量经常供应不足，导致水合温度波动到25℃以上。较高的水合温度一方面会加快反应速率，提高生产效率，另一方面则会造成腈水合酶的快速失活，减少反应批次，增加生产成本。日本三菱丽阳株式会社公开了专利《改良型腈水合酶》(公开号：CN 1961072A)，对腈水合酶β亚基第93位、第167位和219位氨基酸残基进行定点突变，提高了腈水合酶的热稳定性；清华大学在专利“一种突变腈水合酶”中对腈水合酶β亚基的141位Ser、143位Ser、144位Leu进行置换，使得腈水合酶的耐热性、产物耐受性和超声耐受性都有显著提升(专利号：ZL201110415465X)。

发明内容

本发明为了提高腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性，提出一种改造腈水合酶及其应用。

具体技术方案如下：

一种改造腈水合酶通过将原腈水合酶的β亚基第215位氨基酸和α亚基第133位氨基酸之间形成二硫键改造而成；所述原腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:2所示氨基酸序列；所述原腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。

进一步地，所述二硫键形成的方法为：将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的215位Asp置换为Cys，将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的133位Pro置换为Cys。

一种编码上述改造腈水合酶的基因。

进一步地，所述编码改造腈水合酶的基因序列如SEQ ID NO:3所示。