[发明专利]端粒长度检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种从外周血DNA中快速定量检测染色体端粒DNA平均长度的技术方法及其试剂盒，属于分子生物学检测领域。具体是涉及一种通过简单的荧光探针与端粒DNA竞争性杂交及定量测量探针杂交的荧光信号来实现对端粒DNA平均长度的测量的技术，可以应用于人体生物年龄检测，人类慢性病的评估及促衰老和抗衰老药物药效学的检测和评估。

背景技术

端粒（Telomere）是由存在于真核细胞染色体末端的一小段特殊的端粒DNA及其结合蛋白构成的核酸蛋白复合体，是染色体保持完整和稳定的三大要素之一（另外两大要素为着丝粒和复制原点），主要作用是稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接，即保护染色体末端免于融合和退化，保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用。

端粒DNA的组成和功能。端粒DNA由简单的DNA高度重复序列组成。在人类中其重复单位序列为TTAGGG，新生儿脐带血重复序列长度平均约10kb，其长度决定了端粒的长度。端粒DNA具有非常重要的功能，正常体细胞中DNA分子每次复制，端粒DNA就缩短一点。一旦端粒DNA消耗到一定程度，染色体将变得极不稳定，细胞也将会激活凋亡机制，走向凋亡。细胞每有丝分裂一次，就有一段端粒序列丢失，当端粒长度缩短到一定程度，会使细胞停止分裂，导致衰老与死亡。所以，端粒DNA长度反映细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。

组织培养的细胞实验证明，端粒在决定动植物细胞的寿命中起着重要作用，经过多代培养的老化细胞端粒均变短，染色体也变得不稳定。细胞分裂次数越多，其端粒越短，细胞寿命也越短。因此，端粒的长短，往往代表细胞分裂潜力的大小：端粒越短，表明细胞年纪越老，剩余的分裂次数越少；端粒越长，则意味着细胞的活力越强，人体的生殖细胞就具有最长的端粒。所以，Olovnikov提出端粒学说，细胞在每次分裂过程中都会由于DNA聚合酶功能障碍而不能完全复制它们的染色体，最后复制的端粒DNA序列可能会部分丢失，最终造成细胞衰老死亡。因此，端粒的长度是一个人老化程度的最重要和准确的指标。

端粒DNA长度和变化速率的意义。有些细胞类型如生殖系细胞，其端粒长度并不随细胞分裂而变短，秘密在于一种能够修复端粒的端粒酶。端粒酶是一种逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，能以自身RNA为模板，合成端粒重复序列，再连接到新合成DNA链末端，从而修复缩短了的端粒。在人体内端粒酶在大多数的胚胎组织、生殖细胞、炎性细胞、更新组织的增生细胞以及肿瘤细胞中表达。大量实验证实端粒、端粒酶活性与细胞衰老及永生有关。如体外培养不同年龄供体的成纤维细胞发现，随着供体增龄，端粒的长度逐渐变短，有丝分裂的能力明显渐渐变弱；生殖细胞系由于具有较高的端粒酶活性，其端粒可以维持其长度，要比一般体细胞的长；体细胞缺失端粒酶活性，端粒逐渐变短，会逐渐衰老；转化细胞通过端粒酶的活性完全复制端粒以得永生。因此，通过测定端粒的长度，了解端粒、端粒酶活性与细胞衰老的关系具有非常重要的意义。

体细胞端粒长度与有丝分裂能力呈正比，而不同的体细胞其有丝分裂能力是不尽相同的，胃肠黏膜细胞的分裂增殖速度就比较快，神经细胞分裂的速度就比较慢。端粒DNA长度是一个人老化速度的最重要和准确的指标，它会随着人们年龄的增长而缩短，是衰老的最佳生物标志物。但是，每条染色体都有两个端粒，每个端粒的端粒DNA长度都可能有所不同，这给端粒长度的测定带来了困难。另外，端粒的绝对长度与寿命的关系并不成正比，体细胞端粒长度与个体的寿命及不同组织器官的预期寿命并非一致，例如鼠的端粒比人类长近5-10倍，寿命却比人类短得多。因此，测定端粒长度的缩短速度也是非常重要的方面。

端粒长度的变化速度与氧化应激关系密切。研究表明氧化应激在一定程度上可以引起人淋巴细胞端粒长度的缩短；维生素C具有一定的抗氧化作用，它能减低过氧化损伤，从而减缓端粒缩短的速率。糖尿病的病理特征就是糖脂代谢异常，其中氧化应激在糖尿病的发生发展过程中起到了关键性的作用。有研究表明，T1DM组外周血白细胞端粒长度较对照组明显缩短，胰岛素抵抗和2型糖尿病患者外周白细胞端粒长度也均明显缩短，而2型糖尿病患者端粒长度减短的幅度更为明显。胰岛素抵抗时端粒长度进一步减短可作为2型糖尿病的一个独立危险因素。因此，研究端粒DNA的长度与人体慢性疾病之间的关系是一个崭新的医学研究方向。