[发明专利]一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法

说明书

本发明涉及一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法，该方法首先通过硫酸盐还原菌液体富集培养基对土壤中的微生物进行转接筛选，接着采用改进后的稀释涂布‑叠皿夹层法以及筛选培养基培养菌株，第三步利用普通叠皿双层平板法分离纯化上一步所得菌株，最后在保存培养基中保存培养。该方法克服了现有技术存在的菌液不能均匀地涂布渗透在第一层平板上、菌液稀释后不利于其生长、菌落容易上下重叠甚至出现杂菌生长等不足，具有用材简便、筛选效率高、筛选周期短、所得菌种转化率高等优点。

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法。

背景技术

目前，运用生物工程等高科技生物技术，培育能够用于固定重金属的植物和土壤微生物超级工程菌，并运用于土壤污染治理是目前环境科学、环境工程学、植物生理学、微生物学等研究中最活跃的前沿领域之一。微生物能通过氧化还原、甲基化和去甲基化作用转化重金属，将有毒物质转化成动植物不可利用的形态。

硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacterium，简称SRB下同)是自然界中能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等硫氧化物以及元素硫还原形成硫离子，由于重金属硫化物的溶度积普遍较小，硫离子能够立即与微量重金属离子结合生成生物不能利用的形态，因此硫酸盐还原菌可以用作处理固定环境中的重金属离子。SRB菌在工业管道的腐蚀、受重金属污染的废水及酸性矿山废水的环境修复中都扮演着重要角色。

SRB为严格的厌氧菌，但随着研究的深入，已有研究结果表明SRB并非严格意义上的绝对厌氧而是兼性厌氧，但总体上来说SRB对氧还是极其敏感的，因此对其培养与分离关键要采用严格的厌氧技术。SRB可选用的培养方法有很多，例如叠皿夹层法、稀释摇管法、Hungate滚管技术，还可以利用厌氧袋、厌氧罐、厌氧手套箱等。稀释摇管法的不足之处是观察与挑取菌落比较困难，Hungate滚管法以及利用厌氧设备的方法则受到技术方法和设备材料成本的制约，而叠皿夹层法实质是将菌夹在上下两层培养基之间，使其造成一个相对无氧的环境，从而使SRB能在夹缝中生长。叠皿夹层法的优点是培养物均采用涂布生长于营养琼脂夹层中，取菌落时可很方便地做到定点取菌，同时该方法不需要另外创建一个无氧环境，省时、省力，容易实现的同时具备了所有好氧、厌氧分离方法的优点。

然而传统的叠皿夹层法分离菌一般不能均匀地涂布渗透在第一层平板上，且菌液经过稀释后氧化还原电位会随着稀释倍数的增大而升高，对于硫酸盐还原菌的生长很不利。此外在第二层琼脂层的倒入过程中稀释液会随着扩散入第二层中，从而出现菌落上下重叠甚至出现杂菌生长的第二层表面的现象，不易获得单菌落，给分离和筛选菌落带来一定的难度。为了继承传统厌氧培养分离法的优点，克服其缺点，本发明根据科研实际需要对硫酸盐还原菌(SRB)的稀释涂布-叠皿夹层法分离培养方法进行了改进。

发明内容

本发明针对现有硫酸盐还原菌筛选技术存在的上述问题，提供一种从土壤中富集并利用改进后的叠皿平板法筛选、分离、纯化出有较高重金属离子耐受性的硫酸盐还原菌的方法。该方法操作更加简便，提高了筛选分离的效率，缩短了筛选分离周期。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法，包括以下步骤：(a)将预处理后的土壤加入到硫酸盐还原菌液体富集培养基中进行厌氧培养，所得富集液接种至新的硫酸盐还原菌液体富集培养基中再次进行厌氧培养，转接培养多次后得到富集菌液；(b)将富集菌液稀释成不同浓度，向其中加入L-半胱氨酸、抗坏血酸和硫酸亚铁铵备用，将筛选培养基倒入培养皿中，待其冷凝后分别将不同浓度的稀释液涂布在平板上，待稀释液渗透后先后两次倒入筛选培养基，冷凝后依次形成第二层、第三层，将培养皿密闭后恒温培养；(c)将灭菌后的筛选培养基倒入培养皿中冷凝备用，挑取步骤(b)第二层菌株生长层中生长明显的黑色单菌，在新配制的平板上划线分离，再将筛选培养基倒入划线分离后的平板上，密封后反复多次分离培养；(d)将划线分离得到的单菌落接种到保存培养基内，恒温培养即得。