[发明专利]一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法

权利要求书

1.一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）将预处理后的土壤加入到硫酸盐还原菌液体富集培养基中进行厌氧培养，所得富集液接种至新的硫酸盐还原菌液体富集培养基中再次进行厌氧培养，转接培养多次后得到富集菌液；

（b）将富集菌液稀释成不同浓度，向其中加入L-半胱氨酸、抗坏血酸和硫酸亚铁铵备用，将筛选培养基倒入培养皿中，待其冷凝后分别将不同浓度的稀释液涂布在平板上，待稀释液渗透后先后两次倒入筛选培养基，冷凝后依次形成第二层、第三层，将培养皿密闭后恒温培养；

（c）将灭菌后的筛选培养基倒入培养皿中冷凝备用，挑取步骤（b）第二层菌株生长层中生长明显的黑色单菌，在新配制的平板上划线分离，再将筛选培养基倒入划线分离后的平板上，密封后反复多次分离培养；

（d）将划线分离得到的单菌落接种到保存培养基内，恒温培养即得；

所述筛选培养基的成分包括：0.4-0.6g/L的K₂HPO₄, 0.1-0.2g/L 的CaCl₂，0.8-1.0g/L的NH₄Cl，1-2g/L的MgSO₄·7H₂O，1-2g/L的NaCl，0.4-0.6g/L的Na₂SO₄, 2.0-3.0g/L的C₃H₅O₃Na, 0.5-0.6g/L的L-半胱氨酸，0.5-0.6g/L的抗坏血酸，0.5-0.6g/L 的Fe(NH₄₎₂(SO)₂以及2wt%的琼脂；配制时先将其他原料混合并在121℃下灭菌20min，接着降温至55℃后加入L-半胱氨酸、抗坏血酸、Fe(NH₄)₂(SO₄)₂，调节pH至8.0-8.5。

2.根据权利要求1所述的一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法，其特征在于，所述硫酸盐还原菌液体富集培养基的成分包括：0.4-0.6g/的K₂HPO₄，1-2 g/L的MgSO₄·7H₂O，0.4-0.6g/L的Na₂SO₄，0.1-0.2g/L的CaCl₂，1-2 g/L的NaCl，0.8-1.0g/L的NH₄Cl，1.0-2.0g/L的酵母膏，配制好后在121℃下灭菌20min，调节pH至8.0-8.5。

3.根据权利要求1所述的一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法，其特征在于，所述保存培养基的成分包括：0.5-0.7g/L的K₂HPO₄, 0.1-0.2g/L 的CaCl₂，1-1.2g/L的NH₄Cl，1-2 g/L的MgSO₄·7H₂O，2-3 g/L的NaCl，0.4-0.6g/L的Na₂SO₄, 3.0-4.0g/L的C₃H₅O₃Na, 0.5-0.6g/L的L-半胱氨酸，0.5-0.6g/L的抗坏血酸，配制时先将其他原料混合并在121℃下灭菌20min，接着降温至55℃后加入L-半胱氨酸、抗坏血酸，调节pH至8.0-8.5。

4.根据权利要求1所述的一种利用改进的叠皿平板法筛选分离硫酸盐还原菌的方法，其特征在于：步骤（a）中首先用筛网对土壤样品进行筛选预处理，接着按照1g:200-220mL的比例将土壤加入到灭菌后的硫酸盐还原菌液体富集培养基中，在其表面覆盖一层液体石蜡并充氮气，放入30℃的恒温摇床中以100-120r/min的转速进行厌氧培养。