[发明专利]一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型构建方法

说明书

本发明提供了一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法，其主要步骤分为：(1)微流控芯片的制备；(2)三维类脑在微流控芯片上的发育；(3)施加尼古丁暴露。该方法主要结合了新兴的hiPSCs来源的三维类脑组织和可灌流的微流控芯片，通过加以不同浓度的尼古丁刺激，模拟妊娠期尼古丁暴露对胎儿早期脑发育的影响。该模型作为创新的体外器官发育疾病模型，不仅利于直观观察尼古丁对脑发育的形态学影响，也可以借鉴各种检测方法，研究尼古丁对脑发育影响的分子学和细胞学机制。本发明并且很好地模拟了脑早期发育的微环境，可替代动物模型和传统的二维培养方式，为研究妊娠期尼古丁对胎儿早期脑发育的影响提供了有力的新平台。

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术和组织工程的领域，具体涉及一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型构建方法。

背景技术

病理条件下组织和器官的分子和细胞水平机制研究能更好地了解、控制和治疗疾病。传统的生物学方法用于疾病的机制研究或建立疾病模型主要包括二维细胞培养方式和动物模型。二维细胞培养无法模拟生理条件下细胞的微环境，不能完全反映细胞在病理条件下的形态学和分子水平的改变。动物实验目前主要是使用鼠、果蝇、线虫等模式生物，虽然模式生物来源方便、培养条件简单，但由于种属差异，它们很难完全反映各种条件下人体各器官和组织的生理变化。而对于人体的研究在保证最低损伤和方便观察的前提下，较为常用的有核磁共振、CT等，但是这些方法不具实时监测特点，并且很多都无法应用于胎儿发育。

近几年来各种干细胞来源的类脑发育得到了有效发展，包括神经干细胞、肠干细胞、胚胎干细胞以及诱导多能干细胞iPSCs。类脑的形成来源于拟胚体EBs，是由干细胞特异性分化并自组装成具有三维结构的多细胞聚集体，在体外进一步发育成具有一定结构和功能特异性的组织，一定程度上模拟了早期脑发育的过程。类脑技术在模拟脑发育，药物筛选和细胞替代疗法以及疾病模型的建立和研究等方面提供了一个独特的平台，弥补了二维细胞培养分化以及动物模型存在种间差异的不足，具有广泛的应用前景。

尽管这类技术有潜在的优势和应用，仍然面临很多局限和不足。首先，由于三维细胞团的结构特点，使得内部细胞由于缺少氧气和营养，出现中心细胞坏死现象，极大限制了类脑发育的程度，包括体积大小、功能成熟度等，而在生理情况下组织和脑中分布着血管网络用于提供充分的氧气和营养物质，是传统方法很难实现的。其次，传统方法中如使用旋转反应器培养类脑需要消耗大量的培养基和培养空间，成本较高并且可操作性不强，不利于施加不同的条件刺激。最后，传统方法主要是利用细胞自组装和化学因子诱导形成类脑，没有时空上的因素控制及物理因素的参与。因此，结合现有的工程化手段尤其是微流控技术，有望优化类脑技术。

微流控芯片作为细胞培养载体，有几大优势：首先，借助微流控芯片技术可根据实际应用设计不同的通道尺寸，提供一定的空间限制即物理因素控制，并维持细胞的三维生长状态。其次，流体控制有助于促进营养物质和氧气的交换，减少细胞凋亡或细胞团中心坏死现象，为细胞培养提供良好的生存环境。最后，PDMS作为微流控芯片的制作材料，具有良好的透光和透气性，可进行细胞的实时监测和观察并有利于细胞对氧气的充分利用，维持细胞的生长状态。但是目前将微流控技术与类脑技术相结合，建立人属的疾病模型领域尚属空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法，该方法使用微流控芯片灌流系统通过三维培养和流体控制等要素，模拟体内脑发育的微环境，不仅保证了发育过程中充分的营养物质和氧气的交换，实现了脑早期发育特征，并具有低成本、易操作、可原位示踪和实时监测的特点。

本发明一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法，其步骤主要分为三部分：(1)微流控芯片的制备；(2)三维类脑在微流控芯片上的发育；(3)施加尼古丁暴露。

所述步骤(1)微流控芯片的制备，具体为：