[发明专利]一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型构建方法

权利要求书

1.一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法，其特征在于其该方法主要步骤分为：

（1）微流控芯片的制备；所述微流控芯片包括：细胞外基质混悬液入口（1）、三维通道（2）、二维灌流通道（3）、二维培养基通道（4）、培养液入口（5），所述二维灌流通道（3）、二维培养基通道（4）和三维通道（2）交界处有小柱形状的连通处，可用于营养物质传输；所述微流控芯片的二维灌流通道（3）和二维培养基通道（4）的宽度都为0.5 mm-1 mm，三维通道的宽度为1.5 mm-2.5 mm，所有通道的高度均为600-800 um；

（2）三维类脑在微流控芯片上的发育；

（3）施加尼古丁暴露;

步骤（3）施加尼古丁暴露，具体为：

（1）类脑发育第11天时，转移到微流控芯片上，并进行灌流操作，此时施加尼古丁暴露；

（2）对照组使用NDM培养基，样品组使用含尼古丁浓度为0.5-50 uM 的NDM培养基；

（3）样品组的芯片的所有培养基通道均置换为含尼古丁的NDM；

（4）尼古丁处理至三维类脑发育16-30天时，进行后续检测;

尼古丁的浓度范围为0.5-50 uM，以模拟生理情况下的尼古丁浓度;

步骤（2）三维类脑在微流控芯片上的发育，具体为：

（1）将2×10⁵~6×10⁵个干细胞消化成单细胞加入带有坑状结构的PDMS芯片中形成拟胚体EBs，并加入神经诱导培养基NIM进行诱导；EBs在NIM中培养到第11天时，将EBs转移到微流控芯片上，使用浓度为2-10 mg/ml的Matrigel重悬EBs，并用100 ul的去尖枪头将EBs注入微流控芯片的三维通道内，将含有EBs的微流控芯片置于37℃培养箱30-40 min，使Matrigel凝固；将培养基通道内补加神经分化培养基NDM，静止培养6-8 h；

（2）静止培养后进行灌流操作，将微流控芯片的二维灌流通道连接注射器和注射泵，设置流速20-40 ul/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养，继续培养15-30天后，并实时追踪，鉴定发现微流控芯片上的EBs可以进行持续的生长和分化，经鉴定可以形成含有不连续的特定脑区及类似大脑皮层结构的类脑，可模拟早期的脑发育过程；

所述NDM培养基，所用培养基为神经分化培养基 ，其基础成分为体积比为1:1的DMEM/F12和Neuralbasal medium，另外需添加占总体积1％ B27（50×），占总体积0.5％N2（100×），占总体积0.5％ NEAA（100×），占总体积1％GlutaMAX（100×），占总体积1％penicillin-streptomycin（100×），0.05 mM beta-mercaptoethanol；

所述NIM培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积1％N2（100×），占总体积1％GlutaMAX（100×），占总体积1％NEAA （Non Essential Amino Acid，100×），1 µg/mlheparin，占总体积1％penicillin-streptomycin（100×）。

2.按照权利要求1所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法，其特征在于步骤（1）所述微流控芯片制备：由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为聚二甲基硅氧烷的聚合物，封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。

3.按照权利要求1所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法，其特征在于：所述干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。