[发明专利]液相色谱串联质谱检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸和/或同型半胱氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及液相色谱串联质谱检测技术领域，特别涉及液相色谱串联质谱检测尿液、血浆或血斑中甲基丙二酸、甲基枸橼酸和/或同型半胱氨酸的方法。

背景技术

甲基丙二酸是缬氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、胆固醇和奇数链脂肪酸分解途径中，甲基丙二酰辅酶A在异常代谢情况下的旁路产物，是由于基因突变导致的甲基丙二酰变位酶或甲基钴胺素活性下降引起的甲基丙二酰辅酶A代谢受阻，造成甲基丙二酸，甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积，引起脑、肝、肾等多脏器损伤，以上状况临床归为甲基丙二酸血症。

甲基丙二酸血症是一种常染色体隐性遗传疾病，根据酶缺陷的类型分为甲基丙二酰变位酶自身缺陷及其辅酶钴胺素(维生素B12)代谢缺陷两大类，依据异常指标不同又分为单纯性甲基丙二酸血症与甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症，二者以同型半胱氨酸含量是否升高为判断依据。

甲基枸橼酸是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸和奇数链脂肪酸分解中由于丙酰辅酶A羧化酶活性缺乏导致体内蓄积的丙酸及其相关代谢产物中特异性的一种有机酸，以上代谢情况异常归为丙酸血症。同时在甲基丙二酸血症中也伴有甲基枸橼酸的特异性升高。

丙酰辅酶A是缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸等支链氨基酸和奇数链脂肪酸和胆固醇的常见氧化降解产物，被丙酰辅酶A羧化酶催化可以转化为甲基丙二酰辅酶A，后者最终转化为琥珀酰辅酶A进入三羧酸循环。所以，甲基丙二酸血症和丙酸血症是一条代谢通路上不同酶缺陷引起的不同症状，在血斑串联筛查中统一提示血丙酰肉碱异常，需要进行尿液有机酸或者基因突变位点的检测来分辨诊断。

目前一般采用气相色谱质谱联用检测尿中的甲基丙二酸和甲基枸橼酸，同型半胱氨酸则采用酶联免疫试剂盒，液相色谱法或液相色谱质谱法检测血清或血浆中的含量。尿液，血浆的检测常用100-200ul样本，甚至更多，临床婴幼儿样本采集量越大配合采集难度越高，采集质量也越难控制。血斑由于含血量少，除了血液本身物质的干扰，还存在采血滤纸生产过程中的物质干扰，对于测定痕量物质增加了难度。

目前，面临串联筛查血丙酰肉碱异常时，如何寻找一种方便，快速，测定准确，节省样本的方法可以同时检测甲基丙二酸，甲基枸橼酸和同型半胱氨酸用以分辨甲基丙二酸血症单纯性，合并同型半胱氨酸型和丙酸血症至关重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中不能同时检测甲基丙二酸，甲基枸橼酸和同型半胱氨酸、检测样本用量大和检测时间长等问题，提供一种液相色谱串联质谱检测尿液，血浆或血斑中甲基丙二酸、甲基枸橼酸和/ 或同型半胱氨酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

液相色谱串联质谱检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸和/或同型半胱氨酸的方法，检测物质为：同时检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸和同型半胱氨酸中的两种或三种，以及单独检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸或同型半胱氨酸；

检测方法包括样品前处理、液相色谱串联质谱检测；

样品前处理：

1)血斑样品前处理：取1/4～3/4直径8mm的血斑样本，加入含有内标物的萃取剂，振荡孵育，然后吹干，残余物进行衍生反应，干燥后复溶，得到待测样品；

2)血浆和尿液样品前处理：取20-40ul检测样本，加入含有内标物的蛋白沉淀剂，离心沉淀蛋白；上清液干燥后进行衍生反应，干燥后复溶，得到待测样品；

液相色谱串联质谱检测：对所述待测样品用液相色谱串联四级杆质谱进行检测；采用正离子模式，扫描方式采用多反应检测MRM。

进一步地，所述方法还包括定性判断或定量计算：定性判断依据甲基丙二酸、甲基枸橼酸和同型半胱氨酸的相对保留时间，以及甲基丙二酸定量离子对、甲基枸橼酸定量离子对和同型半胱氨酸定量离子对的丰度比；定量计算依据甲基丙二酸、甲基枸橼酸和同型半胱氨酸与对应内标物在内标曲线上的峰面积比值计算，定量计算时采用定值质控品的测值作为测定质量标准控制，测值不能超过定值的±20％。

进一步地，所述的甲基丙二酸，甲基枸橼酸和同型半胱氨酸的对应内标物包括3d-甲基丙二酸、3d-甲基枸橼酸和8d-同型半胱氨酸。

进一步地，所述萃取剂为乙腈：水：甲酸为3：2：0.02比例配制的含内标物和DTT的溶液；所述衍生反应为与盐酸正丁醇的衍生反应；所述萃取剂、盐酸正丁醇和复溶剂的体积比为3：2：2。