[发明专利]液相色谱串联质谱检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸和/或同型半胱氨酸的方法

权利要求书

1.液相色谱串联质谱检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸和/或同型半胱氨酸的方法，其特征在于：

检测物质为：同时检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸和同型半胱氨酸中的两种或三种，以及单独检测甲基丙二酸、甲基枸橼酸或同型半胱氨酸；

检测方法包括样品前处理、液相色谱串联质谱检测；

样品前处理：

1)血斑样品前处理：取1/4～3/4直径8mm的血斑样本，加入含有内标物的萃取剂，振荡孵育，然后吹干，残余物进行衍生反应，干燥后复溶，得到待测样品；

2)血浆和尿液样品前处理：取20-40ul检测样本，加入含有内标物的蛋白沉淀剂，离心沉淀蛋白；上清液干燥后进行衍生反应，干燥后复溶，得到待测样品；

液相色谱串联质谱检测：对所述待测样品用液相色谱串联四级杆质谱进行检测；采用正离子模式，扫描方式采用多反应检测MRM。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括定性判断或定量计算：定性判断依据甲基丙二酸、甲基枸橼酸和同型半胱氨酸的相对保留时间，以及甲基丙二酸定量离子对、甲基枸橼酸定量离子对和同型半胱氨酸定量离子对的丰度比；定量计算依据甲基丙二酸、甲基枸橼酸和同型半胱氨酸与对应内标物在内标曲线上的峰面积比值计算，定量计算时采用定值质控品的测值作为测定质量标准控制，测值不能超过定值的±20％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的甲基丙二酸，甲基枸橼酸和同型半胱氨酸的对应内标物包括3d-甲基丙二酸、3d-甲基枸橼酸和8d-同型半胱氨酸。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述萃取剂为乙腈：水：甲酸为3：2：0.02比例配制的含内标物和DTT的溶液；所述衍生反应为与盐酸正丁醇的衍生反应；所述萃取剂、盐酸正丁醇和复溶剂的体积比为3：2：2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为乙醇：水：甲酸为8:3:0.3比例配制的含内标物和DTT的溶液；所述衍生反应为与盐酸正丁醇的衍生反应；所述样本、蛋白沉淀剂、盐酸正丁醇和复溶剂的体积比为3：10：5：8。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色谱分离参数包括：色谱柱：1.7μm或2.6μm C18，3.0*30-100mm或4.6*100-150mm，色谱柱柱温：35-45℃，进样量:8-12μl，流速：0.4-0.6ml/min，流动相：A相：含0.1％甲酸和2mmol甲酸胺的水；B相：含0.1％甲酸和2mmol甲酸胺的80％乙腈；流动相梯度：0-1.0分钟，A相90％，B相10％；1.0-2.5分钟，A相90％-60％，B相10％-40％；2.5-2.6分钟，A相60％-40％，B相40％-60％；2.6-5分钟，A相40％-15％，B相60％-85％；5.0-5.1分钟，A相15％-5％，B相85％-95％；5.1-5.8分钟，A相5％，，B相95％；5.8-6.5分钟，A相5％-0％，B相95％-100％；6.5-6.6分钟，A相0％-90％，B相100％-10％；6.6-7.5分钟，A相90％，B相10％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述质谱采集参数包括：电离源:电喷雾电离ESI源；离子源加热温度：135～165℃；去溶剂气：700～900L/hr；去溶剂气温度：350～450℃；锥孔吹气：40～60L/hr；毛细管电压2.3～2.7kv；出口电压90-210v；入口电压0.13-0.2v；锥孔电压20-25v；碰撞电压10-15v。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述定值质控品，其中血斑定值质控品的配制方法为：用0.8％-0.9％生理盐水清洗商品化牛全血的血红细胞得红细胞悬液，0.8％-0.9％生理盐水配制3％-5％牛血清蛋白溶液，所述红细胞悬液与所述3％-5％牛血清蛋白溶液按体积比1：1等量混合，添加甲基丙二酸、甲基枸橼酸和同型半胱氨酸的标准品得到。