[发明专利]一种在蛋白纳米笼内部包装外源物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体而言涉及一种在蛋白纳米笼内部包装外源物质的方法。

背景技术

蛋白纳米笼简称蛋白笼，是由一种或几种蛋白质亚基自组装形成的直径为10～200nm的中空笼状结构，如病毒样颗粒(Virus-likeNanoparticle，VLP)、铁蛋白(Ferritin)、细菌微区(BacterialMicrocompartment，BMC)等。利用蛋白笼易于制备、生物相容性好、均质性高、解聚组装状态可人为调控等优势可制备多功能纳米结构和器件。常用的制备方式之一是通过分子自组装在蛋白笼内部包装外源物质。外源物质的类型包括纳米材料、蛋白质、核酸、药物等。大量研究表明，包装外源物质的蛋白笼在生物医学成像、生物传感、递送、诊疗、催化等领域具有重要应用价值。

目前，变换溶液条件控制解聚组装是在蛋白笼内部包装外源物质的通用技术。蛋白笼首先解聚形成寡聚体，再与待包装的外源物质混合；依赖于外源物质和寡聚体的亲和作用、静电吸引、或者外源物质上带有的核酸作为包装信号，寡聚体和外源物质发生相互作用；溶液从解聚条件变换为组装条件后，蛋白笼发生组装的同时将外源物质包装在内。例如，通过改变pH、盐离子浓度、氧化还原条件，在猴病毒40(SV40)VLP和红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)VLP可包装多种外源物质。然而，一些具有重要应用前景的蛋白笼稳定性很强，导致其解聚需要极端的溶液条件，如细菌噬菌体(MS2)、乙肝病毒核心蛋白(HBc)、鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(P22)VLP以及哺乳动物铁蛋白等。极端的溶液条件易造成待包装外源物质的沉淀、变性、失活等，进而导致外源物质不能被包装或包装后丧失功能。由于外源物质的活性或功能对于后续成像，递送，传感，治疗等应用至关重要，因此，急需研发一种对外源物质具有良好兼容性的包装技术。

发明内容

发明人在长期实践中发现：与胶束、微管的组装类似，蛋白笼的组装存在临界组装浓度，当蛋白笼组分的浓度低于临界组装浓度时，即使在组装条件下，寡聚体也不会组装成蛋白笼而继续维持解聚状态。利用蛋白笼解聚与组装的可控性及临界组装浓度，通过蛋白笼组分浓度的提高驱动蛋白笼的组装，本发明可灵活选择组装条件，从而保证不影响待包装外源物质的稳定性和活性，实现外源物质的无损包装。本发明提供了一种在蛋白纳米笼内部包装外源物质的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种在蛋白纳米笼内部包装外源物质的方法，包括以下步骤：

S1：测出蛋白笼的临界组装浓度；

S2：将蛋白笼解聚成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，直至蛋白笼组分的浓度低于临界组装浓度；

S3：向寡聚体中加入外源物质并混匀，得到混合物，浓缩该混合物，直至蛋白笼组分的浓度高于临界组装浓度使组装暨包装发生，纯化即可。

进一步，所述步骤S1中，蛋白笼的临界组装浓度的测定包括以下步骤：

S11：配制系列蛋白笼组分浓度呈梯度变化的寡聚体溶液，并分别透析到组装缓冲液中，得到蛋白液；

S12：将蛋白液离心并取上清液，将上清液作为超滤初始液进行超滤，取滤过液；

S13：以蛋白笼组分浓度的自然对数为横坐标，滤过液与超滤初始液的蛋白浓度比值为纵坐标，作散点图，拟合玻尔兹曼类型的曲线，曲线斜率绝对值最大时横坐标对应的蛋白浓度值即为临界组装浓度。

进一步，所述步骤S12中，蛋白液离心转速为10000rpm，离心时间为10-30min，超滤上清液的超滤管截留分子量为100KD，超滤转速为4000rpm，超滤时间为10-30min。

当蛋白笼组分的浓度小于临界组装浓度时，寡聚体能够穿过超滤管的滤膜，滤过液与超滤初始液的蛋白浓度比值较大，接近100％，曲线斜率绝对值较小，接近0。随着蛋白笼组分浓度的增大，寡聚体相互作用，导致滤过液与超滤初始液的蛋白浓度的比值逐渐减小，曲线斜率绝对值增大。当蛋白笼组分的浓度达到临界组装浓度时，寡聚体开始组装形成蛋白笼而不能穿过超滤管滤膜，滤过液与超滤初始液的蛋白浓度比值突然下降，此时，曲线斜率绝对值最大。当蛋白笼组分的浓度大于临界组装浓度时，组装效率随浓度增大逐渐接近100％，曲线斜率绝对值逐渐接近0。

进一步，所述步骤S3中，用聚乙二醇20000浓缩混合物，直至蛋白笼组分的浓度高于临界组装浓度，使组装暨包装发生，采用蔗糖密度梯度离心的方法纯化包装后的产物。

进一步，所述浓缩混合物及超滤上清液的过程均在4℃环境下进行。

本发明的有益效果：