[发明专利]一种可对活细胞内microRNA21进行原位成像的纳米放大自参比探针

说明书

本发明涉及一种对活细胞内microRNA(miRNA)原位成像的纳米放大自参比探针及其制备方法。该探针是将核酸发卡修饰的上转换纳米粒子(UNP‑H1)和荧光分子修饰的发卡分子(H2‑F)通过脂质体包裹而成。当探针进入细胞后，UNP‑H1和H2‑F被释放，只有当H1与miRNA杂交后，H2可以取代miRNA而与UNP‑H1杂交，释放出的miRNA启动下一个循环以放大信号。在近红外光激发下，UNP的发射带1(EEB1)与F之间发生发光共振能量转移(LRET)。以UNP的发射带2(EEB2)通道为自参比，LRET与EEB2通道的发光强度比值(I_LRET/I_EEB2)可用于细胞内miRNA的相对定量。

一、技术领域

本发明涉及一种对细胞内microRNA原位成像的纳米放大自参比探针及其制备方法。

二、背景技术

MicroRNA(miRNA)作为一种重要的肿瘤标志物，它在细胞中的分布和表达水平与癌症的发生发展有着重要关联。因此，实现细胞内miRNA的原位成像和检测对于肿瘤的早期诊断和预后监测都有着重大意义。常用于细胞内miRNA成像的探针主要分为两类：分子信标(MB)和核酸功能化纳米探针。然而它们在细胞内miRNA的成像检测中不能全面解决以下3个难题：(1)细胞内低丰度的miRNA信号难以实现有效放大；(2)核酸探针稳定性差，容易被细胞内的核酸酶降解而导致假阳性信号的产生；(3)由于缺少内参，实验中获取的信号强度受仪器参数波动的影响，很难保持数据的稳定和可靠性。因此，发展用于活细胞内microRNA原位成像的纳米放大自参比探针具有重要的意义。

本发明将上转换纳米粒子(UNP)与“催化杂交组装”(CHA)无酶信号放大技术结合起来，制备了包含核酸修饰的上转换纳米粒子(UNP-H1)和荧光染料修饰的发卡分子(H2-F)的纳米放大自参比探针。 CHA可以实现信号放大，提高了待测miRNA的检测灵敏度。UNP需要用近红外光激发，从而消除了细胞自荧光。UNP对于其上负载的核酸分子具有保护作用，使其耐受核酸酶的降解，因此可以解决纳米探针稳定性的问题。同时，UNP单激发多发射的特点，使得可以使用其中一个发射通道作为参比通道而实现检测信号的校正，提高方法的稳定性。

三、发明内容

本发明的目的是：构建可对活细胞内待测miRNA产生响应的纳米放大自参比探针，当待测miRNA存在时，引发CHA放大过程，探针的2个组件UNP-H1和H2-F杂交生成UNP-H1/H2-F复合物，UNP的发射带1(EEB1)与F产生发光共振能量转移(LRET)信号，从而以miRNA21分子(miR21)为检测对象实现了活细胞内miRNA的原位成像。通过自参比通道EEB2对LRET通道进行校正，利用LRET通道与 EEB2通道的信号比值(I_LRET/I_EEB2)与miRNA浓度成正比的关系，实现了对不同细胞中miR21的相对定量比较。

本发明提出的探针的制备过程如图1所示。以聚丙烯酸(PAA)修饰的UNP(UNP-PAA)作为载体，通过共价作用在其表面连接氨基修饰的发卡H1，制得UNP-H1。然后将UNP-H1与H2-F共同包裹在脂质体囊泡(lipo-3000)中，制得用于活细胞内miRNA成像的探针。

本发明通过以下技术方案来实现：

1)H1的核苷酸序列为 5’-NH₂-TCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACT。如图1所示，在N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)存在下，将UNP-PAA表面的羧基利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 (EDC)活化，将H1发卡分子通过5’端氨基的共价作用修饰到UNP-PAA表面，形成结构稳定的UNP-H1。