[发明专利]一种黑色素转运抑制率的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及黑色素检测技术领域，具体涉及一种黑色素转运抑制率的快速检 测的方法。

背景技术

黑色素是广泛存在于人的皮肤、粘膜、视网膜、软脑膜及胆囊与卵巢等处， 它的存在与人体皮肤、毛发及眼睛的颜色密切相关。黑色素的主要生物功能有抵 抗紫外线，减少炎症，皮肤病的发生，因此，黑色素细胞中的黑色素的存在以及 含量有着极为重要的生物学意义。黑色素是由黑素细胞产生的,成熟的黑素细胞 位于表皮细胞的基底层,是一种树枝状细胞。每一个黑素细胞连接大约36个角朊 细胞,构成一个表皮黑素单位。皮肤黑素的产生过程包括从黑素细胞的迁移,黑素 细胞的分裂成熟,黑素小体的形成,黑素颗粒的转运到临近的角质形成细胞内，最 终导致皮肤的色素沉着。目前，白皙的皮肤是众多亚洲人群(特别是女性)所追 求的目标，这就促进了各种皮肤美白的手段的衍生。而对于美白化妆品的开发， 黑色素成为最直接的作用靶点。另外，目前大部分对于黑色素的检测仅限于黑色 素细胞内黑色素含量的测定——针对胞内黑色素合成的抑制作用检测，而忽略了 美白活性物质对黑色素转运的抑制作用的验证。因此，开发一种快速、有效的黑 色素细胞外黑色素检测方法将具有很好的实用价值和现实意义。

黑色素细胞在正常培养状态下，会自主分泌黑色素，使培养基呈现黑色。黑 色素是一种包含多种二羟基吲哚和苯酚单位的异质聚合物，是皮肤组织中最重 要的生色团之一。这一独特的化学结构决定了黑色素具有良好的光学性质。相对 于传统的黑色素转运的检测方法——在黑色素细胞与角质细胞共培养体系中通 过共聚焦显微镜或流式细胞仪观察黑色素小体从黑色素细胞向角质细胞转运的 情况，本发明的方法有望实现灵敏度高、操作简便、时间短、成本低，同时可得 到黑色素转运抑制率的数据的胞外黑色素检测。目前常用的黑色素细胞外黑色素 检测方法——共聚焦显微镜或流式细胞仪观察黑色素小体在细胞共培养体系中 的转运情况，可以通过CFDA-SE荧光标记的黑色素细胞与角质细胞共培养，最 后在共聚焦显微镜中观察细胞共培养体系中黑色素小体的转运情况；利用这种方 法可实现黑色素转运情况的检测。但是，这种方法有如下几个缺点：1)实验步 骤较多且复查，实验周期长，不能实现高效快速的检测；2)定性检测，该法的 检测标准是通过肉眼的判定，只能得到定性的结果，无法定量，无法计算出黑色 素转运的抑制率；3)灵敏度不高，在显微镜下肉眼判断黑色素是否存在，只有 达到肉眼可识别的颗粒大小才能被检测出，那些更小的颗粒则无法检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑色素转运抑制率的快速检测的方法，该方法灵敏 度高、操作简单便捷，可准确算出黑色素转运的抑制率。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现：一种黑色素细胞的黑色素转 运抑制率的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)配制完全培养基。

(2)取对数期的黑色素细胞，用步骤(1)配制的完全培养基将细胞调成特 定密度的细胞悬液并加进100mm培养皿中(同时设置空白对照组、阳性对照组 和实验组)，把细胞放进培养箱中培养，待细胞贴壁后，往实验组中加入特定浓 度的实验样品，培养48小时后，收集细胞培养基，将培养基按顺序加进96孔板 中，每孔200uL。

(3)采用酶标仪对步骤(2)中的空白对照组的细胞培养基进行全波长扫描， 放置样品，对样品进行扫描，放上待测样品，执行扫描，即得到全波长的样品光 谱图；扫描出来的吸光度值和波长的关系曲线就是培养基中黑色素的光谱曲线； 根据扫描的光谱曲线确定最大吸收波长的位置。

(4)根据步骤(3)得到的波长测量步骤(2)中的培养基的吸光度，根据公 式算出黑色素转运的抑制率。

在上述黑色素细胞的黑色素转运抑制率的检测方法中：

步骤(1)中的完全培养基为无酚红DMEM培养基，含10％FBS和1％双抗。

步骤(2)中得到细胞悬液的具体步骤为取对数期的黑色素细胞，去掉原有 培养基，取2mlPBS冲洗培养瓶底部的细胞，倒掉PBS，外加入2ml胰酶，消化 3min后，加入步骤(1)的完全培养基3ml终止消化，并把细胞从培养瓶底部吹 打下来，转移至15ml离心管中，于低速离心机中1200r/min离心5min，弃去上 清液，往细胞团中加入适量完全培养基吹散细胞团，用细胞计数器计算细胞密度， 并把细胞悬液密度调成1×10⁵个/ml，往100mm培养皿中加入10ml细胞悬液。

步骤(2)中采用的培养箱为CO2培养箱，37℃，含体积百分含量为5％的 CO2。