[发明专利]一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组慢病毒滴度检测技术领域，尤其涉及的是一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法。

背景技术

慢病毒载体是目前应用最广泛的基因运载工具之一，在基因治疗研究和转基因动物的制备中已显示出其广阔的应用前景。慢病毒载体是一种反转录病毒载体，其中以人类免疫缺陷性病毒(HIV-1)载体研究最为深入。重组慢病毒载体既能感染分裂期细胞，也能感染非分裂期细胞。它可携带较大的外源基因并稳定整合和表达，加之其诱发的宿主免疫反应相对较小，使得重组慢病毒载体具有较为广阔的应用前景。

无论何种目的使用重组慢病毒，都有必要准确地检测病毒滴度。目前，重组慢病毒滴度的检测方法有：报告基因GFP荧光检测法、慢病毒外壳蛋白p24的抗原抗体法和检测逆转录酶活性的酶学法。这些方法多存在耗时费力、检测成本较高、病毒用量多、不适于非报告基因载体等缺点，所以，有必要建立一种快速、简便、准确的慢病毒滴度检测方法。

发明内容

本发明的目的在于解决重组慢病毒滴度的检测方法耗时费力且成本高的问题，提供了一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，操作方便，检测结果精确。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于：包括如下3个部分：慢病毒gag基因的引物设计、构建检测慢病毒的标准品和荧光定量PCR法测定滴度，所述慢病毒gag基因的引物为：

上游引物：5'GACCAGCGGCTACACTA 3'

下游引物：5'TATGTGCCCTTCTTTGC 3'。

进一步地，构建检测慢病毒的标准品包括如下步骤：

S1、通过普通PCR扩增出相应片段，运用T载体构建出一个新的克隆质粒；

S2、将新的克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；

S3、根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品。更进一步地，荧光定量PCR法测定滴度包括如下步骤：

S1、检测前一天，对293T细胞传代，每个24孔中加1×105个细胞，体积为500μl；

S2、次日，取病毒浓缩液，按10倍稀释法，稀释成3个梯度；

S3、选取所需的细胞孔，吸去100μl培养基，加入100μl稀释好的病毒溶液，放入CO2培养箱中培养；

S4、20～25小时后，加入新鲜培养基500μl，小心操作，不要吹起细胞，维持细胞正常生长；

S5、4天后，抽提RNA，经逆转录获得cDNA；

S6、运用荧光定量PCR仪，根据标准品上机检测样本中gag基因的具体拷贝数；

S7、病毒整合入细胞基因组后，使得细胞基因组含两条gag基因，即一个慢病毒颗粒＝gag拷贝数/2。

更进一步地，所述步骤S3中的培养箱的温度为37℃，CO₂的浓度为5％。

更进一步地，所述步骤S3中的细胞在培养箱中培养24小时。

本发明提出一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，操作方便，检测结果精确。由于慢病毒gag基因编码p55的蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白(p24)，因此gag所编码的蛋白是病毒粒子成熟所必需的。本发明是以慢病毒自身必须携带的基因gag设计引物，运用荧光定量PCR检测重组慢病毒滴度。与现有技术相比，本发明将实时定量PCR的检测引物设计在慢病毒载体的gag区，因此检测不依赖于所携带的外源基因，并且适于非报告基因载体的慢病毒，其应用范围更广。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，包括如下步骤：

(1)慢病毒gag基因的引物设计

(2)构建检测慢病毒的标准品,步骤如下：

S1、通过普通PCR扩增出相应片段，运用T载体构建出一个新的克隆质粒；

S2、将新的克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；

S3、根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品。

其中，拷贝数计算公式为：拷贝数＝6.02×1023×核酸浓度÷(DNA length×660)；拷贝数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml；