[发明专利]一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法

权利要求书

1.一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于：包括如下3个部分：慢病毒gag基因的引物设计、构建检测慢病毒的标准品和荧光定量PCR法测定滴度，所述慢病毒gag基因的引物为：

上游引物：5'GACCAGCGGCTACACTA 3'

下游引物：5'TATGTGCCCTTCTTTGC 3'。

2.根据权利要求1所述的一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于：构建检测慢病毒的标准品包括如下步骤：

S1、通过普通PCR扩增出相应片段，运用T载体构建出一个新的克隆质粒；

S2、将新的克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；

S3、根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品。

3.根据权利要求1所述的一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于：荧光定量PCR法测定滴度包括如下步骤：

S1、检测前一天，对293T细胞传代，每个24孔中加1×105个细胞，体积为500μl；

S2、次日，取病毒浓缩液，按10倍稀释法，稀释成3个梯度；

S3、选取所需的细胞孔，吸去100μl培养基，加入100μl稀释好的病毒溶液，放入CO₂培养箱中培养；

S4、20～25小时后，加入新鲜培养基500μl，小心操作，不要吹起细胞，维持细胞正常生长；

S5、4天后，抽提RNA，经逆转录获得cDNA；

S6、运用荧光定量PCR仪，根据标准品上机检测样本中gag基因的具体拷贝数；

S7、病毒整合入细胞基因组后，使得细胞基因组含两条gag基因，即一个慢病毒颗粒＝gag拷贝数/2。

4.根据权利要求1所述的一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于：所述步骤S3中的培养箱的温度为37℃，CO₂的浓度为5％。

5.根据权利要求1所述的一种基于gag基因检测重组慢病毒滴度的方法，其特征在于：所述步骤S3中的细胞在培养箱中培养24小时。