[发明专利]一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法

说明书

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接检测血清或血浆中循环microRNA(miRNA)的实时荧光定量RT‑qPCR方法。所述方法包括：S1：裂解血清或血浆中的外泌体及miRNA蛋白复合体，离心后得到循环miRNA粗提物；S2：miRNA加尾及逆转录；S3：RT‑qPCR定量检测。本发明miRNA直接荧光定量RT‑qPCR扩增方法[Direct S‑Poly(T)Plus,简称DSPP]中，不需要提取核酸，且miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成，操作简便，缩短时间，可在95分钟内完成cDNA的制备。该技术体系灵敏度与stem‑loop方法相比提高数十甚至上百倍，建立了一种非常简便、灵敏、高效、快捷、廉价的miRNA检测的技术体系。该技术体系尤其适合于临床应用推广及其从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中。miRNA通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)结合，降解靶mRNA或者阻止其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达。功能上，miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA表达被精细调控，具有严格的时空特异性。研究发现，血液中存在着循环miRNA且非常稳定，更为重要是，循环miRNA的异常与许多疾病的发生发展密切相关，可作为癌症等重大疾病早期诊断和预后评估的新型生物标记物。

长期以来，基于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测技术一直都被认为是最灵敏的miRNA检测手段之一，比较常用的有poly(A)加尾法(Shi R,Biotechnique.2005,39(4):519-525)和茎环引物(Stem loop)法(Chen C,Nucleic Acids Res.2005,33(20):1-9)。Poly(A)加尾法是利用poly(A)聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly(A)尾巴，然后用含有Oligo(dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性，因此Poly(A)加尾法在降低检测成本的同时，也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个茎环结构，3’端通常具有6个与miRNA3’端配对的特异性碱基，可以特异性的进行逆转录反应。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针，在高通量的miRNA分析中成本相对昂贵，此外，依赖于6个匹配碱基在结合力度方面显然是不够的，会显著降低cDNA合成的效率。

Kang K等发明了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly(T)法，分别在其专利申请CN102154505A(在该专利中称为S-S-Oligo(dT)法，所用引物称为S-S-Oligo(dT)引物)和文章(Kang,K,PloS one.2012.7,e48536.)中进行了公开。在S-Poly(T)方法中，所用引物从5’端开始依次是14-20个碱基的PCR通用引物序列，14-20个碱基的通用探针序列，8-30个dT及与目的miRNA分子的3’端3-8个核苷酸互补配对的特异性序列。与poly(A)加尾法和茎环引物法相比，S-Poly(T)方法的特异性和灵敏度都大大提高，灵敏度至少提高10倍以上。在升级版的S-Poly(T)Plus方法中(专利申请号：201510558101.5)，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录一步反应完成，因此在操作简便性和逆转录效率方面，S-Poly(T)Plus技术又有进一步改进和提高，其总体灵敏度比S-Poly(T)方法提高2-8倍。

现有miRNA检测方法都是基于纯化的RNA为模板，由于提取核酸中RNA沉淀和回收的不完全，将会不可避免的造成一些RNA丢失。此外，RNA提取过程费时，易造成污染和降解。

可见，现有技术还有待完善。

发明内容