[发明专利]一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法

权利要求书

1.一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，其特征在于，所述方法，包含以下步骤：

S1、裂解离心：利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解，使miRNA从样本中释放出来；短暂离心后，所得上清液即为粗提RNA；其中，裂解用试剂包括组分：20ul 2×lysis buffer、1ul蛋白酶K，所述裂解用试剂对应处理20ul样本；所述2×lysis buffer包含以下终浓度的组分：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、20mM MgCl₂；pH为8.0；

S2、加尾逆转录：将所述步骤S1中所获得的粗提RNA进行加Poly(A)尾及S-Poly(T)特异性逆转录；

S3、RT-qPCR定量检测：以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT-qPCR定量检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中裂解用试剂的反应条件为50℃处理20分钟，然后95℃保持5分钟。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中的离心条件为：10，000～14，000g，4℃条件下离心5～15分钟。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中的离心条件为：13,000g，4℃条件下离心5分钟。

6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤S2中加尾逆转录反应体系中所加入粗提RNA模板的体积百分比为5～75％。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中加尾逆转录的反应体系包括：0.5-7.5uL上清模板、1±0.2μL的0.5μmol/L RT primer、1±0.2U的PolyAPolymerase、100±20U的MMLV、2.375-0.625uL的reaction buffer、RNase-free Water补足至10μL；加尾逆转录的反应条件为：37～42℃保温50～70min，74～76℃保温3～7min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中real-time PCR反应体系为：4×qPCR reaction Buffer 5μL、1μmol/L的Forward Primer 4μL、10μmol/L的universal reverse primer0.4μL、10μmol/L的universal Taqman probe0.5μL、100×ROXRerference Dye0.2μL、Hotstart Alpha Taq Polymerase0.0125μL、cDNA 0.5μL、RNase-free Water加至20μL；反应条件为：预变性95℃ 5分钟，变性95℃ 10s，退火60℃ 40s，40个循环。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述样本为血浆、血清、尿液、眼泪、乳汁、唾液、痰液或粪便抽提上清。