[发明专利]一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用

说明书

本发明公布了一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用。该CRISPR/Cpf1系统包括携带优化FnCpf1基因的重组载体和pCR质粒，其中：所述优化FnCpf1基因的序列如SEQ ID No：1所示，其重组载体为含有重组酶gp60和gp61基因的大肠杆菌‑分枝杆菌穿梭载体；所述pCR质粒含有启动子驱动的直接重复序列‑间隔序列‑直接重复序列单元，其中所述间隔序列包含靶标序列连入位点。利用该CRISPR/Cpf1系统在分枝杆菌中进行CRISPR/Cpf1辅助的同源重组，能获得较高的重组效率，实现对分枝杆菌的基因编辑。

技术领域

本发明涉及基因编辑系统，特别涉及一种用于分枝杆菌基因编辑的CRISPR/Cpf1系统。

背景技术

结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，导致全球每年有150万人死于该疾病。由于多耐药性结核分枝杆菌突变株的形成，结核病威胁正在逐步扩大。因此，在分枝杆菌中进行遗传操作，特别是构建基因敲除菌株和点突变菌株，对于了解分枝杆菌生长发育、分化、毒力相关基因的功能和耐药基因的机制，进而开发减毒疫苗和治疗药物，都具有重要意义。但是由于结核分枝杆菌生长缓慢(大约16-24小时复制一代)，致病性(需要在3级生物安全实验室进行操作)以及会出现高频率的异常重组现象，导致对结核分枝杆菌的研究一直受到限制。

分枝杆菌中进行基因操作的方法一般是利用同源重组产生等位替换。同源重组是细菌间水平基因转移的一种基本特征，即被转移的DNA片段不能独立复制，必须同受体染色体具有同样序列的DNA分子发生断裂、交换再重新连接的过程。由于分枝杆菌自身重组蛋白活性非常低，发生同源重组的概率非常低，常利用结核分枝杆菌噬菌体Che9c中的重组蛋白gp60和gp61来介导携带短同源臂(50-500bp)的AES线性双链DNA或单链DNA作为模板，靶向染色体互补序列，使其发生所需突变。该方法只需在分枝杆菌内表达噬菌体重组蛋白并且引入相应的等位交换底物(allelic exchange substrates,AESs)，就可构建染色体基因敲除、点突变、小片段插入等。但该方法仍需要利用抗性标签来筛选重组子。如果研究冗余基因的功能，则需要对多种基因进行无标签突变；而去除掉抗性标签则需要利用两步法或引入序列特异性重组酶切除抗性标签(抗性基因两边有同向的两个短的DNA序列可以被特定的重组酶识别)，切除后基因组上仍会留下一个短的能够被重组酶识别的DNA序列。这些都将使重组操作更为复杂且耗时更长，并且无法得到一个真正的无痕突变株。

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR-associated protein)系统，即成簇的规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白，广泛存在于细菌和古生菌基因组中，作为一种获得性免疫系统来有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件造成的干扰。

CRISPR防御的过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。在适应阶段，CRISPR系统会将一段与质粒或噬菌体上基因片段(原间隔序列，proto-spacers)同源的短片段DNA插入到前导序列与第一段重复序列之间，每一次插入活动都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复序列(Repeats)-间隔序列(Spacers)单元，这样使得CRISPR基因座中存在着此种质粒或噬菌体的序列信息，为适应性免疫奠定了结构基础。在表达阶段，CRISPR基因座会被转录成一段长链的CRISPR RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)，这一前体将会在重复序列处被剪切，而后被Cas内切酶加工成小crRNA。成熟的crRNA会与Cas蛋白结合形成Cas/crRNA效应复合体，在干扰阶段发挥作用。在干扰阶段，crRNA作为复合体的向导，协助其寻找与其同源的外源核酸靶标，当crRNA与原间隔序列互补配对完成时，Cas核酸酶会对DNA进行切割从而对靶标进行降解。在这3个阶段中，适应阶段又可称为信息处理阶段，此阶段的作用机制在不同的CRISPR系统中高度保守，主要作用蛋白为Cas1和Cas2蛋白；而表达和干扰阶段又被称为执行阶段。