[发明专利]一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cpf1系统及重组系统的用于分枝杆菌基因组编辑的双质粒系统，由携带优化的FnCpf1基因的重组载体和pCR质粒组成，其中，所述优化的FnCpf1基因的序列如序列表中SEQ ID No：1所示；所述重组载体为含有重组酶gp60和gp61基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体，所述优化的FnCpf1基因在启动子的驱动下进行表达；所述pCR质粒含有启动子驱动的直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元，其中所述间隔序列包含靶标序列连入位点。

2.如权利要求1所述的双质粒系统，其特征在于，所述重组载体是在pJV53载体上插入了启动子驱动表达的所述优化的FnCpf1基因后的载体。

3.如权利要求1所述的双质粒系统，其特征在于，所述靶标序列连入位点是包含两个或更多个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点。

4.如权利要求3所述的双质粒系统，其特征在于，所述直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元的序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

5.如权利要求1所述的双质粒系统，其特征在于，所述pCR质粒中由Hsp60启动子负责驱动直接重复序列-间隔序列-直接重复序列单元。

6.如权利要求1所述的双质粒系统，其特征在于，所述pCR质粒上含有选择标记基因，并包含复制起点oriE及温度敏感性复制子pAL5000ts。

7.权利要求1所述的双质粒系统在分枝杆菌基因组编辑中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，通过在分枝杆菌中进行CRISPR/Cpf1辅助的同源重组操作实现基因组编辑，具体包括：将位于靶标基因中PAM序列3’端的靶标序列插入到pCR质粒的靶标序列连入位点中；制备针对靶标基因的等位交换底物；将插入靶标序列的pCR质粒和等位交换底物同时导入分枝杆菌细胞中，所述分枝杆菌细胞含有权利要求1中所述的携带优化的 FnCpf1基因的重组载体；筛选获得靶标基因被编辑的分枝杆菌克隆。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述等位交换底物是单链DNA或线性双链DNA。