[发明专利]基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法

说明书

本发明提供一种基于GC‑MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，通过以下步骤实现：(1)采用GC‑MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品；(2)利用PCA和PLS‑DA对数据进行分析，结合SPSS17.0，并利用NIST数据库进行代谢物鉴定找出最终的差异代谢物；(3)通过MetPA在线分析软件对差异代谢物进行通路分析：本发明通过采用GC‑MS联用技术对大鼠血清及尿液样品进行分析，并分别鉴定大鼠血清样品和尿液样品中的差异代谢物，通过对差异代谢物进行代谢通路分析，可从整体水平综合评价辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的作用机制，为中药组方的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。

技术领域

本发明属于中药学研究领域，尤其涉及一种基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法。

技术背景

中药的有效性和实用性已经毋庸置疑，但中药组方的研究至今没有取得突破性进展，主要的两个问题无非是中药组方的成分以及不甚明确的作用机制。中药成分的复杂主要是因为自身化合物的种类多，不同的化合物在不同条件下相互作用，相互变化，难以测得其真实成分。其作用机制主要表现为多成分、多靶点的协同整合作用，难以用单一的成分及靶点来概括其作用机制。中药的多成分、多靶点协同整合作用，组方中的动态变化，都成为了中药组方深层次开发的难点。

代谢组学(Metabonomics/Metabolomics)即通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后(如基因变异或环境变化后)，其代谢产物(内源性代谢产物)种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学在药物开发、植物学、毒理学、营养科学等研究领域具有广阔的前景，同时为药物筛选、作用机制研究、安全性评价及毒理研究提供了新方法。代谢组学是强调将机体看做一个整体进行研究，与中药治病整体性、多靶点协同整合作用极其相似，为中药组方研究提供了崭新的、强有力的技术手段。代谢组学成为研究中药及中药组方作用机制的重要途径。

“辛芍组方”为贵州少数民族民间验方，由灯盏细辛和赤芍配伍组成。在民间将两者以汤剂煎服用于治疗偏瘫，具有通经活络、活血化瘀的功效，主要将其用于预防和辅助治疗中风、偏瘫，而且疗效显著。尽管其具有较好的疗效，但是其作用机制尚不清楚，限制了辛芍组方的深度开发。理论上，辛芍组方发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用机制应该是“多途径、多成分、多靶点”，但目前仍缺乏有效的实验方法和技术手段进行验证。而代谢组学的产生可为阐明辛芍组方的作用机制提供强大的支持。

发明内容

本发明的目的是针对辛芍组方发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用机制不明确的难点，提供一种基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法。

实现本发明的技术方案为：一种基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)采用GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品：

随机将大鼠分为模型组、假手术组和辛芍组，放入代谢笼中进行观察，期间正常饮食及饮水；各组大鼠按一定剂量，连续给药10天，收集不同时间点的各组大鼠的血清样品和血尿液样品，进行初步处理和保存；然后再次对血清样品进行前处理、尿液样品进行前处理；对大鼠血清和尿液样品进行方法学考察，包括日内精密度考察、日间精密度考察、重复性考察、冻融稳定性考察和QC样本考察，建立GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品的指纹图谱分析方法；

(2)利用PCA和PLS-DA对数据进行分析，结合SPSS17.0，并利用NIST数据库进行代谢物鉴定找出最终的差异代谢物：