[发明专利]基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法

权利要求书

1.一种基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)采用GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品：

随机将大鼠分为模型组、假手术组和辛芍组，放入代谢笼中进行观察，期间正常饮食及饮水；各组大鼠按一定剂量，连续给药10天，收集不同时间点的各组大鼠的血清样品和血尿液样品，进行初步处理和保存；然后再次对血清样品进行前处理、尿液样品进行前处理；对大鼠血清和尿液样品进行方法学考察，包括日内精密度考察、日间精密度考察、重复性考察、冻融稳定性考察和QC样本考察，建立GC-MS联用技术检测分析大鼠血清样品及尿液样品的指纹图谱分析方法；

所述的血清样品进行前处理的具体方法为：取解冻后血清样本100μL于1.5mL的EP管中，加入甲醇250μL，涡混3min，冰浴10min，在4℃，10000rpm条件下，离心10min；取血清甲醇萃取液250μL，置GC进样瓶，N₂吹干；加50μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混匀，在70℃，肟化1h，加50μL衍生化试剂，混匀，在70℃，衍生化1h，冷却后，转移至1.5mLEP管中，在4℃，15000rpm条件下，离心10min，移取上清液至内插管中，供GC-MS分析；

所述的尿液样品进行前处理的具体方法为：取冻存后尿样在室温下解冻，取尿样上清液50μL，加60U的脲酶，涡混30s，在37℃恒温孵育箱中孵化15min，加入180μL的甲醇，混匀，在13000rpm，4℃条件下，离心10min；取200μL上清液至GC进样瓶中，N₂吹干；脱水后的样品加入50μL15mg/mL甲氧胺吡啶溶液，涡混30s，培养振荡器中在30℃，200rpm条件下肟化90min；加入有1％的TMCS的MSTFA50μL，涡混30s，在70℃保持60min，放冷，加入120μL正庚烷，涡混30s，转移至1.5mL的EP管中，混匀，在12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液至内插管中，待GC-MS分析；

(2)利用PCA和PLS-DA对数据进行分析，结合SPSS17.0，并利用NIST数据库进行代谢物鉴定找出最终的差异代谢物：

在获得GC-MS数据后，用Agilent MSD Chemstation分析软件将原始数据转换为NetCDF格式，导入基于R编程软件的XCMS的软件进行色谱峰提取、去噪、峰匹配、保留时间的矫正、数据导出、保存，将得到的数据进行峰面积归一化处理，采用修正80％规则去除数据缺失值，将获得的数据进行分析；利用SIMCA-P13.0软件对导入的血清样品数据、尿液样品数据进行模式识别分析，假手术组与模型组采用PCA与PLS-DA方法建模，利用变量重要性投影分析VIP值，结合SPSS17.0进行T检验，按照VIP值>1且T检验时P<0.05的标准，筛选出差异代谢物；

将GC-MS检测总离子流图导入NISTAMDIS软件中，进行解卷积分析，利用NIST11数据库对GC-MS检测的内源性差异代谢物进行定性分析，选择质谱数据库中匹配度大于700的物质，进行分析鉴定，进行去硅烷化反应，得到最终的差异代谢物；

(3)通过MetPA在线分析软件对差异代谢物进行通路分析：

为了探索脑缺血再灌注损伤引起的代谢通路的变化，以及给予辛芍组方后对这些代谢通路的影响，将血清样本及尿样样品筛选出的差异代谢物导入MetPA在线分析软件中进行代谢通路分析；通过代谢通路分析后所得影响值，判断代谢通路在代谢网络中是否具有重要影响。

2.根据权利要求1所述基于GC-MS联用技术的辛芍组方抗脑缺血再灌注损伤的代谢组学研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的模型组、假手术组和辛芍组的具体的处理方法为：模型组和辛芍组采用改良的Longa方法成功制备中脑动脉栓塞大鼠模型，缺血1h后进行再灌注，缓慢外拉栓线使其球端回至颈总动脉内，恢复大脑中动脉的供血，中动脉缺血再灌注造模完成后，放回代谢笼中进行饲养；假手术组除不插栓线外，其它步骤均和模型组一致。