[发明专利]一种胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶突变体及其基因和应用

说明书

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及一种对胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2‑m突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G及其基因和应用。本发明的三个突变体的胰蛋白酶抗性均有明显提高，经相同浓度的胰蛋白酶处理后，lipY2‑m的抗胰蛋白酶半衰期为41.5min，K36G/K39T的抗胰蛋白酶半衰期为43.9min；R63G的抗胰蛋白酶半衰期为45.7min；组合突变体K36G/K39T/R63G的抗胰蛋白酶半衰期为46.8min，对胰蛋白酶抗性的半衰期分别提高了5.8％、10.1％和12％，显示出了在治疗胰腺功能不全等疾病方面的潜在应用价值。

技术领域

本发明属于蛋白质工程和酶工程技术领域，具体内容涉及一种胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T/R63G及其基因和应用。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)又称甘油酯水解酶，它是一类特殊的酯键水解酶，与只能在单相催化底物反应的酯酶不同，脂肪酶在其催化过程中需要有界面，这个界面分隔两个物理相，在分子水平上是一至两层有序的相邻分子层，一层亲水，一层疏水。它在油水界面可催化甘油三酯的水解生成脂肪酸、甘油、甘油单酯或二酯。同时脂肪酶在疏水介质中还可催化酯化、转酯、酯交换等反应。

脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，大多数微生物脂肪酶的最适pH作用范围在中性或偏碱性，少数为酸性。细菌脂肪酶最适pH在4.0-11.0，真菌脂肪酶最适pH在4.0-10.0，其中真菌脂肪酶具有在有机溶剂中高活性，且提取成本比较低的优点。因此，脂肪酶在饲料添加剂、食品加工、生物制药等诸多领域有广泛的应用。

脂肪酶是人体内脂肪代谢所必须的酶，若缺失将会引起健康问题。通过外部口服脂肪酶，可以帮助人体内的脂肪消化，同时脂肪酶还可以用于恶性肿瘤的治疗。血液中的脂肪酶还可以用于胰脏疾病的诊断，当胰脏发生病发后，血液中的脂肪酶含量显著上升。慢性胰腺炎等胰腺疾病往往会导致胰腺外分泌功能不全和减少脂肪消化酶的产生，这反过来又会导致脂肪吸收不良，腹泻和营养不良。目前主要的治疗方法是每餐胰脂肪酶代替疗法，即口服补充脂肪酶来治疗胰腺功能不全。而代替脂肪酶必须通过食道，胃和十二指肠才能到达小肠发挥作用。一般情况下正常人胃的平均pH为3，然而大部分脂肪酶在低pH值下很不稳定，甚至可能失活。当食物从胃中被转移到十二指肠后，许多脂肪酶的活性又会被胆汁盐所抑制。

据报道，来源于耶氏解酯酵母的酸性脂肪酶lipY2在较低pH值下仍表现出较高的活性和稳定性，且活性几乎不受胆盐的影响。正由于lipY2独特的生化特性，使其成为胰脂肪酶替代疗法的一个理想的候选酶。然而，这种酶的实际效果往往因为其很容易被胰蛋白酶所降解而降低。脂肪酶普遍存在于自然界中，但目前已确定的脂肪酶不是对胆盐和消化酶敏感就是在较低的pH值下很不稳定，它们没有一个整合这些所有的优势。因此，利用蛋白质工程手段对lipY2进行酶分子改造，提高其在肠道中对胰蛋白酶水解的抗性至关重要。

随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行改造已成为当前酶工程领域研究的热点。

发明内容

本发明的目的是通过定点突变的方法对脂肪酶进行改造，使改造后的脂肪酶在对胰蛋白酶的抗性上性质更加优良。

本发明的另一目的是提供编码上述突变的脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组质粒。

本发明还提供了一种工程菌株，其含有如前所述的脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的基因或如前所述的重组质粒。

本发明实现目的的技术方案如下：