[发明专利]硬叶兜兰菌根化育苗方法

权利要求书

1.硬叶兜兰菌根化育苗方法，其过程包括以下步骤：

a.硬叶兜兰菌根真菌的分离、培养：提取硬叶兜兰的2-3年生根，分离出根内内生菌，将内生菌丝团转接到PDA培养基上，恒温后镜检，找出萌发的菌丝团，切取萌发菌在PDA培养基上二次纯化培养，最后试管保存菌种；所选取并培育应用于硬叶兜兰培育使用的两种菌株均属于瘤菌根菌属；1号菌株的菌丝基本特征为：隔为桶孔隔膜，桶孔覆垫无穿孔，弧形，菌丝细胞为双核，BDPDA培养基上菌落淡褐色，平滑均匀较薄，无气生菌丝，贴培养基生长，具同心环，边缘整齐，具有香味，菌丝的生长速度0.10-0.12mm/h，菌丝近直角分枝，直径2.15-5.03μm，细胞长17.35-119.02μm，分枝第一隔与分枝点的距离为1.63-4.18μm，近直角分枝，距分枝起源很近处有横隔，念珠状细胞球形，少数柱状或椭圆形，大小16.95-37.82μm×36.89-52.93μm，念珠状细胞链包含5个细胞；BDCMA培养基上贴培养基生长，无气生菌丝，生长速度0.24-0.25mm/h，菌丝呈近直角分枝，有隔，直径3.85-8.56μm，细胞长53.21-296.34μm，分枝第一隔与分枝点的距离为2.67-5.27μm；还利用了2号菌株，属于瘤菌根菌属的菌株，基本特征：BDPDA培养基上菌落乳白色，平滑，蜡质，后期中央形成绒白色菌丝，散发式生长，边缘不整齐，具有香味，菌丝的生长速度0.06-0.07mm/h，菌丝呈锐角分枝，有隔，直径2.85-8.31μm，细胞长30.51-86.63μm，分枝第一隔与分枝点的距离为1.21-4.90μm；BDCMA培养基上贴培养基生长，无气生菌丝，生长速度0.19-0.24mm/h，菌丝呈锐角分枝，有隔，直径3.67-5.98μm，细胞长26.34-106.95μm，分枝第一隔与分枝点的距离为2.06-4.93μm；

b.菌苗共培养阶段

选取生长一致，长势良好的硬叶兜兰试管组培苗，且具有2-3片叶，2-3条根系作为试验材料，将组培苗接种在MS附加6-苄基氨基嘌呤(6-BA)培养基上及吲哚乙酸（IBA）培养基上，培养2周后，选取无污染瓶苗；利用打孔器打取2号菌株的硬叶兜兰内生菌菌饼2片，转接至上述无污染瓶苗；

c.种苗栽培基质的配制

菌液的制作：①号营养液含有KNO₃，NH₄NO₃，KH₂PO₄，MgSO₄·7H₂O ，CaCl₂·2H₂O，KI ，H₃BO₃，MnSO₄·4H₂O，ZnSO₄·7 H₂O，Na₂MoO₄·2H₂O ，CuSO₄·5H₂O，CoCl₂·6H₂O 、蔗糖，120℃高温灭菌20分钟，分装于三角瓶，每瓶装200ml，摇床震荡培养90天；

②号燕麦培养基：含有燕麦，蔗糖，琼脂，120℃高温灭菌20分钟，分装于三角瓶，每瓶装200ml；接种菌株为1号，用直径0.5cm的打孔器打取内生菌片，每瓶接种1片，摇床震荡培养60天；

③号栽培基质：含有树皮、腐殖土、植金石、蛇木、苔藓、松针，混合拌匀，拌匀备用；

④号栽培基质：按下述比例制备 ④号栽培基质，取上述2L①号营养液和2L②号燕麦培养基倒入桶内，将桶内的①号营养液和②号燕麦培养基的菌丝充分研磨拌匀，拌入50L的③号栽培基质，充分拌匀后装入桶内，薄膜密封发酵2周；

d.种苗的移栽

移栽前，将生根瓶苗打开瓶盖，移至常温下炼苗3d，然后，将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，栽种于④号栽培基质中放置在遮光度50%～60%、湿度达80%以上的温室中，2个月后，幼苗成活率达95%以上。