[发明专利]新型的牙周炎DNA疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于口腔疾病防治医学技术领域，具体涉及一种DNA疫苗、制备方法以及其在防治牙周炎中的用途。

背景技术

牙周病是引起牙齿丧失的主要口腔疾病之一，也是危害人类口腔和全身健康的主要疾病；慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因，发病率高。牙周病对牙周组织造成的破坏是持续且不可逆的，一旦发生，以目前的治疗手段很难达到完全康复。此外，牙周病还与某些全身疾病密切相关，是诱发某些系统性疾病如糖尿病、心血管系统疾病等的危险因素，许多临床研究表明牙周病与这些全身疾病相互影响，甚至互为因果。牙周病还可能导致新生儿早产与低体重。近期研究表明，在患有牙周病的早产低体重儿的母体中，产妇静脉血清和脐带血清中各炎性因子水平明显升高，且母体牙周病变程度越高，婴儿孕周越小，出生体重越低。因此，从各个方面来说，探索有效的防治牙周病的药物或疫苗对于提高国民整体健康水平有着重要意义。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)是牙周炎的主要致病菌之一，其在慢性牙周炎和侵袭性牙周炎等口腔疾病的发生发展中发挥着重要的作用。P.gingivalis含有大量的特异性毒力因子，如菌毛、血凝素、脂多糖及蛋白酶等，介导P.gingivalis对牙周组织黏附、定植，进而破坏牙周组织结构。近年来随着分子生物学与免疫学技术的不断成熟，尤其是P.gingivalis基因组DNA被成功测序，为筛选作为疫苗的候选基因提供了可靠的依据。针对上述靶点设计基因疫苗，发挥相应的免疫效应是可行的。

菌毛也是P.gingivalis表面的主要毒力因子之一，菌毛是P.gingivalis表面卷曲的丝状蛋白，它能介导P.gingivalis的定植及其与革登链球菌(Streptococcus gordonii，S.gordonii)的共聚，与P.gingivalis侵入到牙周组织的上皮细胞和结缔组织内有关；同时可刺激致炎性细胞因子的产生，导致骨质吸收和其他炎症反应。菌毛蛋白主要的亚单位为FimA，为其主要的抗原成分，次要成分为FimC、FinD、FimE，分别为fimA下游的fimC、fimD、fimE基因编码，在细胞黏附及定植中发挥重要作用。因此菌毛蛋白基因也是构建牙周炎基因疫苗应用最广泛的抗原基因。

白细胞介素15(IL-15)从肾脏表皮细胞系CV-1/EBNA中克隆出来的一种具有免疫调节作用的细胞因子，属于公用γ链受体的细胞因子家族。IL-15能够诱导NK细胞和CD8⁺T细胞的发育、增殖及活化。IL-15还能促进B细胞特别是B1细胞的增殖分化，使其分化出分泌SIgA的浆细胞。调节Bl细胞向产生分泌性IgA细胞分化的细胞因子主要有IL-15、转化生长因子β(TGF-β)及IL-5等^[10]。这些细胞因子作用已被抗原致敏的B1细胞，经过细胞信号传导，诱导编码IgA不变区基因的表达，实现抗原致敏的B1细胞向产生SIgA浆细胞分化。由此可见，通过提高体内免疫细胞周围IL-15的含量，制造一个利于更多B1细胞转化成分泌型IgA浆细胞的微环境，可以提高黏膜免疫应答的强度。因此本研究选择IL-15作为免疫调节因子。

现阶段，基因疫苗已经成为探索防治疾病的一种有效新措施，作为基因疫苗的重组质粒进入胞内，与细胞同时进行增殖与表达，产生分泌蛋白至胞外，诱导抗原-抗体反应产生体液免疫，同时具有表面抗原效应的抗原可以表达于细胞膜上，从而诱导细胞免疫。因其具有体液免疫及细胞免疫的双重免疫效应，使其成为优于传统灭活疫苗及减毒疫苗的新型疫苗。同时，构建靶向基因疫苗成为现阶段研究的热点，将多种基因串联，以增强其免疫效应。

发明内容

本发明设计将菌毛蛋白基因fimA、SD大鼠IL-15基因整合到真核表达质粒上，制备DNA疫苗，用于口腔牙周炎防治的研究。

据此，本发明提供了一类新型的DNA疫苗、制备方法以及其在防治牙周炎中的用途。

具体地：

一方面，本发明提供了一种新型的DNA疫苗，为pVAX1-fimA/IL-15重组质粒，是由牙龈卟啉单胞菌W83型的菌毛蛋白基因fimA和SD大鼠IL-15基因经IRES基因序列连接后，插入真核表达载体pVAX1质粒得到。

本发明所述的DNA疫苗，为pVAX1-fimA/IL-15重组质粒，所述的pVAX1-fimA/IL-15重组质粒，经酶切去除pVAX1质粒后，得到的fimA/IL-15的DNA序列如SEQ ID:1所示。