[发明专利]一种高效快速分离T‑DNA插入位点侧翼序列的方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法及其用途。

背景技术

随着植物基因工程的飞速发展，农杆菌介导的植物转化技术已经成为植物转基因育种和植物基因功能研究过程中一项重要的方法和技术。T-DNA插入位点侧翼序列的分离和鉴定对转基因植株的遗传分析起着关键作用。目前分离侧翼分离的方法主要有以下几种：

一、TAIL-PCR，其主要原理是基于一端的特异巢式引物和另一端随机简并引物，经过多轮扩增可以分离出侧翼序列；二、反向PCR，这种方法主要是对基因组DNA进行酶切，然后进行自连，通过载体上的特异引物进行侧翼序列分离；三、接头PCR，其主要原理与反向PCR类似，不同的是酶切基因组DNA以后加接头连接代替自连，在扩增过程中用接头的一端引物和载体一端引物配合进行PCR扩增；四、质粒拯救，基本原理是在载体设计的时候在载体T-DNA区加入了质粒复制相关元件，对转基因植株的DNA进行酶切，再进行自连，然后自连DNA转化大肠杆菌，对克隆进行测序验证。以上方法均存在效率低，随机性大和成功率低的特点，如在使用TAIL-PCR分离过程中存在大量的假阳性；在使用反向PCR和接头PCR分离过程中，插入位点附近无合适酶切位点。而且以上方法在涉及到多拷贝T-DNA插入突变体时往往很难将大部分位点分离出来，经常出现不能得到与突变性状共分离的插入位点。因此，如何高效、快速地分离出转化事件中的所有插入位点信息在基因功能分析过程中对T-DNA突变体进行共分离检测和在转基因新品种培育过程中进行后代筛选和遗传稳定性分析均具有重要意义。

随着第二代测序技术的飞速发展，理论上讲，我们可以通过深入重测序的方法，无限加大测序深度从而分析出插入位点信息。但是随着测序深度的加大，数据量过大，不仅会造成数据量的浪费；而且会加大计算资源的消耗。

发明内容

本发明通过利用DNA捕获技术，专门针对T-DNA边界序列进行测序，具有高效，经济和分析简单的特点。即本发明的目的在于克服现有侧翼序列分离技术通量低，效率低和成功率低的不足，结合DNA捕获和第二代测序技术，特异性对T-DNA边界序列进行测序并通过简单分析就能获得T-DNA插入位点的侧翼序列，可以将其运用于植物的基因功能验证和转基因育种与品种改良。

即本发明的第一目的在于提供一种高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，包括以下步骤：

1)提取农杆菌介导的转基因植株的基因组DNA；

2)将基因组DNA片段化，DNA修复、加A和连接后，利用磁珠进行片段选择后进行文库构建，构建的文库与T-DNA边界序列进行杂交捕获以后进行PCR富集；

3)对文库进行高通量测序，对测序数据进行生物信息学分析，获取T-DNA插入位点。

优选地，本发明所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法中，所述步骤1)中提取基因组DNA的方法为CTAB法。

优选地，本发明所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法中，所述步骤2)中基因组DNA片段化的方法为超声破碎法。

优选地，本发明所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法中，所述步骤2)中DNA片段大小为300bp～500bp。

优选地，本发明所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法中，所述步骤2)中DNA修复、加A和连接的方法分别为将DNA双链的片段修复成平末端，并且将5’末端磷酸化；加A：在末端修复后的3’末端加一个腺苷酸；连接：与接头进行连接。

优选地，本发明所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法中，所述步骤2)中使用探针进行杂交捕获。

优选地，本发明所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法中，所述探针为SEQ ID NO 1所示序列.

优选地，本发明所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法中，所述步骤2)中PCR富集的循环数为15～20个循环。

优选地，本发明所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法中，所述步骤3)中测序数据进行生物信息学分析为原始序列经NGS QC Toolkit进行质量控制，获得高质量clean reads，对clean reads采用DNA测序处理，以T-DNA边界序列为参考基因组，提取一端匹配到T-DNA，另一端未匹配的reads序列。后者序列以水稻基因组序列，采用blast软件进行比对分析，根据比对结果设计引物进行后续验证。