[发明专利]一种高效快速分离T‑DNA插入位点侧翼序列的方法及其用途在审
| 申请号： | 201710434000.6 | 申请日： | 2017-06-09 |
| 公开（公告）号： | CN107190003A | 公开（公告）日： | 2017-09-22 |
| 发明（设计）人： | 凌飞;崔莹 | 申请（专利权）人： | 武汉天问生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所11569 | 代理人： | 刘奇 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖新技术开发*** | 国省代码： | 湖北;42 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高效 快速 分离 dna 插入 侧翼 序列 方法 及其 用途 | ||
1.一种高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取农杆菌介导的转基因植株的基因组DNA；
2)将基因组DNA片段化，DNA修复、加A和连接后，利用磁珠进行片段选择后进行文库构建，构建的文库与T-DNA边界序列进行杂交捕获以后进行PCR富集；
3)对文库进行高通量测序，对测序数据进行生物信息学分析，获取T-DNA插入位点。
2.根据权利要求1所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述步骤1)中提取基因组DNA的方法为CTAB法。
3.根据权利要求1所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述步骤2)中基因组DNA片段化的方法为超声破碎法。
4.根据权利要求3所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述步骤2)中DNA片段大小为300bp～500bp。
5.根据权利要求1所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述步骤2)中DNA修复、加A和连接的方法分别为将DNA双链的片段修复成平末端，并且将5’末端磷酸化；加A：在末端修复后的3’末端加一个腺苷酸；连接：与接头进行连接。
6.根据权利要求1所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述步骤2)中使用探针进行杂交捕获。
7.根据权利要求6所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO 1所示序列。
8.根据权利要求1所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR富集的循环数为15～20个循环。
9.根据权利要求1所述的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述步骤3)中测序数据进行生物信息学分析为原始序列经NGS QC Toolkit进行质量控制，获得高质量clean reads，对clean reads采用DNA测序处理，以T-DNA边界序列为参考基因组，提取一端匹配到T-DNA，另一端未匹配的reads序列。后者序列以水稻基因组序列，采用blast软件进行比对分析，根据比对结果设计引物进行后续验证。
10.根据权利要求9所述的的高效快速分离T-DNA插入位点侧翼序列的方法，其特征在于，所述T-DNA边界序列为SEQ ID NO 2所示序列。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于武汉天问生物科技有限公司，未经武汉天问生物科技有限公司许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201710434000.6/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
