[发明专利]一种与生殖支原体MgPa特异结合的受体蛋白及其分离方法和用途

说明书

本发明提供了一种与生殖支原体MgPa特异结合的受体蛋白及其分离方法和用途，本发明首先筛选得到了位于人尿道上皮细胞膜表面的受体蛋白——亲环蛋白。所述蛋白分离自人尿道上皮细胞的细胞膜蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由165个氨基酸组成。本发明利用改进的VOPBA方法筛选rMgPa在人尿道上皮细胞膜上的受体，为进一步阐明Mg可能的黏附和致病机制，为进一步设计受体模拟分子和拮抗分子阻挡Mg黏附入侵宿主细胞，为Mg感染防治提供前期实验基础。因此所述受体蛋白CypA能够用于制备治疗或预防生殖支原体感染性疾病的靶向药物中。

技术领域

本发明涉及一种与生殖支原体MgPa特异结合的受体蛋白——亲环蛋白(Cyclophilin A,CypA)，还提供了该蛋白的分离方法和用途，属于生物工程和疾病诊断与防治技术领域。

背景技术

生殖支原体(Mycoplasma genitalium，Mg)是首次从一名非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物中分离出的一种泌尿生殖道感染支原体。临床研究表明，女性感染Mg可引起宫颈炎、盆腔炎和不孕等；而男性感染则可引起急慢性非淋菌性尿道炎和不育；另外，Mg感染还与人类免疫缺陷病毒(HIV)的机会感染密切相关，是HIV的协同因子，故称之为艾滋病相关支原体。

病原体和宿主细胞膜上相应的受体蛋白的结合是病原体感染宿主的第一步，对其能否感染宿主细胞至关重要。研究表明，Mg必须先黏附于泌尿生殖道或呼吸道黏膜上皮细胞才能感染宿主并定植于感染部位或侵入细胞内。

支原体没有细胞壁，但在Mg的膜上存在较多的膜蛋白。Mg通过细胞膜上的膜蛋白介导其定植到宿主细胞表面而感染致病。生殖支原体黏附蛋白(Mycoplasma genitaliumprotein of adhesion,MgPa)是Mg含量最多的一种膜蛋白，且是一种最主要的黏附蛋白，在介导Mg黏附甚至侵入宿主上皮细胞的过程中发挥着至关重要的作用。自发性的无细胞黏附活性的Mg突变株则缺乏MgPa。Iverson-Cabral SL等的研究也表明在Mg的持续性感染过程中，机体产生的抗体主要针对于MgPa保守的C端可变区，说明MgPa的C端与其免疫原性密切相关。Dehon PM等研究表明针对MgPa C端的抗体能部分抑制Mg对Hep-2细胞的黏附，说明MgPa是一种重要的黏附蛋白，且主要通过其C端黏附于宿主上皮细胞。既然MgPa与Mg的粘附、感染致病有关，因此在宿主细胞上可能存在与MgPa相互作用的受体蛋白。然而，迄今为止，关于Mg通过MgPa与宿主细胞膜上什么受体分子结合，从而导致其黏附或入侵到宿主上皮细胞，尚未见相关报道。

宿主细胞表面的受体是决定生殖支原体对宿主细胞是否易感的关键因素，且是决定生殖支原体的入侵途径、传播方式、和宿主的病理特征的主要因素之一。因此，对生殖支原体受体的研究有助于从分子水平上阐明生殖支原体的致病机理及其与宿主细胞的相互作用的关系，利用人工表达的受体分子或其模拟分子与拮抗分子阻挡生殖支原体与其受体的结合，是防治生殖支原体感染的重要途径。

发明内容

本发明利用超声破碎法提取人尿道上皮细胞(SV-HUC-1cell)的膜蛋白，应用改进的病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)，即利用原核表达并经纯化的MgPa直接与转印至PVDF膜上的细胞膜蛋白组分进行孵育，筛选得到了位于人尿道上皮细胞膜表面的受体蛋白——亲环蛋白。所述蛋白分离自人尿道上皮细胞的细胞膜蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由165个氨基酸组成。

本发明还提供了上述受体蛋白CypA的分离制备方法，包括以下步骤：

(1)对生殖支原体的膜蛋白MgPa进行表达、纯化，制得重组蛋白rMgPa；

(2)采用超声破碎法提取人尿道上皮细胞的膜蛋白；

(3)采用改进的病毒铺覆蛋白印迹技术筛选步骤(2)中制得的膜蛋白中与重组蛋白rMgPa特异结合的膜蛋白，筛选得到一条约17KDa的蛋白；