[发明专利]一种与生殖支原体MgPa特异结合的受体蛋白及其分离方法和用途

权利要求书

1.一种与生殖支原体MgPa特异结合的受体蛋白的分离制备方法，所述受体蛋白分离自人尿道上皮细胞的细胞膜蛋白，命名为亲环蛋白Cyclophinlin A,简称为CypA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，由165个氨基酸组成，其特征在于所述分离制备方法包括以下步骤：

(1)、对生殖支原体的膜蛋白MgPa进行表达、纯化，制得重组蛋白rMgPa；

(2)、采用超声破碎法提取人尿道上皮细胞的膜蛋白；

(3)、采用改进的病毒铺覆蛋白印迹技术筛选步骤(2)中制得的膜蛋白中与重组蛋白rMgPa特异结合的膜蛋白，筛选得到一条约17KDa的蛋白；具体步骤为：

a、SDS-PAGE

将步骤(2)中提取的人尿道上皮细胞膜蛋白，测定浓度后加入蛋白电泳上样缓冲液(5×)，混匀后煮沸5min，1000g离心1min，取10μL上样进行SDS-PAGE分离，分离胶为12％，浓缩胶为5％，电泳条件为：浓缩胶80V，分离胶120V；同时设置对照组；

b、转膜与封闭

(i)PVDF膜的处理及凝胶的平衡：裁剪一张比凝胶片段略大的PVDF膜，将其用甲醇浸泡10-15s后再用去离子水漂洗10s，随后将PVDF膜用转膜缓冲液平衡10min，电泳结束后，将目的片段放置于转膜缓冲液中平衡10min；

(ii)在半干转膜仪中，将已经平衡好的滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸从下到上依次叠加，每层均用玻璃棒将气泡排除，在恒压条件进行转膜：条件为15V，30min；

(iii)PVDF膜浸入封闭液中，4℃过夜，或者室温摇床2h，TBST漂洗5次，每次5min；

c、免疫印迹

(i)rMgPa蛋白孵育：加入rMgPa蛋白，在4℃孵育6h，TBST漂洗5次，每次5min；

(ii)孵育一抗：加入稀释1:1000的兔抗rMgPa的多克隆抗体，37℃孵育2h，TBST漂洗5次，每次5min；

(iii)孵育二抗：加入稀释1:5000的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h，TBST漂洗5次，每次5min；

(iv)显影；

(4)、将步骤(3)中得到的约17KDa蛋白进行质谱分析鉴定，即得到受体蛋白CypA。

2.根据权利要求1所述的受体蛋白的分离制备方法，其特征在于：步骤(2)中，取培养形态良好的人尿道上皮细胞，胰蛋白酶消化5min，加入培养基终止消化，离心6min后收集细胞沉淀；然后加入PBS轻轻吹打细胞沉淀，洗三次；再加入细胞裂解液冰浴20min，加入蛋白酶抑制剂PMSF，超声破碎，10W，5s/次，间歇15s，共计30次，然后2500rpm/min离心10min，取上清离心30min，沉淀用PBS重悬，-80℃保存，即获得人尿道上皮细胞的膜蛋白提取物。

3.权利要求1所述的受体蛋白的用途，其特征在于：利用权利要求1所述的受体蛋白CypA制备治疗或预防生殖支原体感染性疾病的靶向药物中的用途。