[发明专利]一种柠檬黄多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫技术领域，具体的说是涉及一种柠檬黄多克隆抗体的制备方法。

背景技术

柠檬黄又称酒石黄、酸性淡黄、肼黄。柠檬黄之所以能用做食品药品染色剂，是因为它安全度比较高，基本无毒，不在体内贮积，绝大部分以原形排出体外，少量可经代谢，其代谢产物对人无毒性作用。而它的生产所用原料对氨基苯磺酸、酒石酸及2-萘酚-6-磺酸都是基本无毒的物质。因此，世界粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)早在1994年就给了它一个很宽容的每日答应摄用量。若按标准使用柠檬黄，则进入人体的量距每日答应摄用量相差很多。

柠檬黄为一种偶氮型酸性染料，其主要用于食品、饮料、药品及化妆品的着色，也用于羊毛、蚕丝的染色及制造色淀。水溶性合成色素，鲜艳的嫩黄色，广泛用于冰淇淋、雪糕、果冻、酸奶、饮料、罐头、糖果包衣等的着色。根据中国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)规定：用于高糖果汁(味)或果汁(味)或果汁(味)饮料、碳酸饮料、配制酒、糖果、糕点上彩装、西瓜酱罐头、青梅、虾(味)片、渍制小菜、红绿丝，最大使用量0.1g/kg；用于冰淇淋，最大使用量0.02g/kg。用于植物蛋白饮料、乳酸菌饮料，最大用量0.05g/kg。

食用酒石黄人工色素会导致儿童智商降5分，以往的研究显示，食品中的人工添加剂会引发儿童行为障碍。英国南安普敦大学的一项研究结果更发现，食用人工色素会影响儿童智力发育。新华网引述英国《每日电讯报》报导，英国南安普敦大学应英国食品标准局请求，进行食用人工色素对儿童发育影响的研究，整个研究耗资75万英镑。研究结果发现，包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分。

鉴于柠檬黄给人类带来健康的潜在风险，开发一种简单、快捷制备用于检测柠檬黄的多克隆抗体显得尤为重要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种柠檬黄多克隆抗体的制备方法。

本发明提供的技术方案为：

一种柠檬黄多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将制备好的全抗原注射到免疫动物体内；

(2)再加强免疫3次后采血，检测血清效价；

(3)若血清效价达到要求，则大量采血，离心取上清，得到抗血清；

(4)将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料柠檬黄-Agarose，血清中的抗柠檬黄抗体与偶联在填料上的柠檬黄特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得到抗柠檬黄多克隆抗体。

作为优选，步骤(1)中所述的全抗原包括柠檬黄-KLH和柠檬黄-BSA。

作为优选，所述的全抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)先将柠檬黄溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀直到全部溶解，再加入N,N'-二环己基碳二亚胺DCC，室温摇床反应30min，得到柠檬黄-NHS中间体；

(2)取血蓝蛋白KLH或牛血清蛋白BSA，分别溶解在0.1mol/L的磷酸二氢钠溶液中；

(3)将柠檬黄-NHS中间体和BSA或KLH混匀，室温摇床震荡反应2h，经G25Sephadex脱盐后，制得的柠檬黄-KLH疫苗和柠檬黄-BSA疫苗。

作为优选，所述的全抗原柠檬黄-KLH做注射用；所述的全抗原柠檬黄-BSA做检测包被用。

作为优选，步骤(1)中所述的免疫动物为新西兰大白兔。

作为优选，步骤(4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将柠檬黄溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀直到全部溶解，再加入N，N'-二环己基碳二亚胺DCC，室温摇床反应30min，得到柠檬黄-NHS中间体；

(2)取赖氨酸琼脂糖磁珠Agarose中，用0.1mol/L磷酸二氢钠清洗后加入与Agarose等体积的丙酮；

(3)将制备好的柠檬黄-NHS中间体加到赖氨酸Agarose丙酮-磷酸二氢钠悬浮中摇床反应过夜，得到柠檬黄-Agarose；

(4)用100mL丙酮清洗柠檬黄-Agarose，再用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液PBSt清洗，自然滴干后，即得抗原免疫亲和填料柠檬黄-Agarose。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：