[发明专利]一种检测急性早幼粒细胞白血病适配体的筛选方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及急性早幼粒细胞白血病检测技术的研究领域，更具体地说，是可用于分子水平上检测急性早幼粒细胞白血病的核酸适配体及其筛选方法和应用。

背景技术

白血病（leukemia）是一种较常见的造血系统恶性肿瘤，其特点为骨髓及其它造血组织中的白血病细胞异常增生，浸润破坏各种器官和组织，导致该组织和脏器的结构与功能损害。该病死亡率较高，危害性大，病情进展迅速，如不及时治疗，患者通常在患病后数周或数月内死亡。目前对于急性白血病，包括急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的诊断和治疗手段非常有限。APL是一种特殊类型的急性非淋巴细胞白血病，临床特点为起病急、出血重，患者常因为不能早期诊断，失去治疗时机而死亡。这主要是由于对白血病细胞表面特异性分子标记物的认识仍然不是很清楚,缺乏分子水平的诊断，延误诊断及治疗时机。

目前白血病的诊断和分型主要依靠细胞形态学、遗传学以及免疫学等技术，缺乏一种方便、快捷、精准的诊断方法。

临床上不同类型的白血病有不同的化疗方案和病情预后，因此白血病的准确分型对于该病的临床诊断、治疗方案的选择以及预后的判断等意义重大^[4]。

综上，目前临床上对白血病的发生与发展的机制缺乏全面了解，白血病诊断的特异性和准确性还有待进一步提高。因此如何找到白血病细胞特异性分子标记物，从而更深入的了解急性白血病发生与发展的机制，进而研发新的诊断方法，成为目前白血病诊断急需解决的难题。

SELEX技术的出现为肿瘤标志物的寻找带来了新的思路。指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX（Systematic Evolution of Ligands EXponential Enrichment）技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。其基本原理是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，由于单链寡核苷酸片段能形成灵活多变的空间三维结构，理论上可以同各种靶分子结合，一个足够容量（10¹⁵-10¹⁸）的寡核苷酸库包容了所有可能的立体结构，因此有可能从中筛到任何种类靶分子的高亲和力配体。利用这一原理，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留特异的寡核苷酸配体，并以此为模板利用PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮或数十轮反复扩增、筛选过程，最终获得高亲和力高特异性的寡核苷酸配体(aptamer)。aptamer又被称作核酸适配体，是一类新型的分子探针，由于其自身优越性越来越受到人们的关注。核酸适配体功能类似于单克隆抗体，能与靶物质高特异性、高亲和力结合，但与蛋白质类抗体相比，核酸适配体具有更多的优势，如不受免疫条件和免疫原性限制、无免疫原性、识别能力精确、分子小易渗透、可体外人工合成修饰、变性与复性可逆、有利于长期保存和室温运输等。

核酸适配体的出现，打破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识，也为血液肿瘤的早期诊断及研发新的治疗方法提供了新的契机，有望作为一种“化学抗体”应用于白血病的早期诊断和靶向治疗。

本发明以人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞为靶细胞，应用Cell-SELEX技术通过正向及削减筛选过程制备了高特异性和高亲和性的HL-60细胞适配体（ssDNA）。该适配体的特点如下：对急性早幼粒细胞白血病细胞的细胞膜蛋白质靶点具有高度选择性与高度亲和性；急性早幼粒细胞白血病-ssDNA文库的构建，为未来的临床应用提供了省时、简便、成本低、效率高的保证；在适配体合成过程中可依据试验的需要进行生物化学的改造，例如连接生物素、羧基、氨基或者巯基。这些修饰并不影响生物探针对蛋白质靶点的辨认。基于该适配体这一独到的特点，其可以连接药物分子、核酸酶阻抗碱基的修饰（保护核酸不被水解）。这样有利于体内的试验跟踪以及直接将连接的药物分子送达到白血病细胞表面，起到特异诊断与靶向治疗的双重效果。

发明内容

我们应用正向筛选同时穿插反向消减技术完成了高特异性和高亲和性的急性早幼粒细胞白血病细胞适配体（AML-M3-ssDNA）的构建。因此本发明提供特异结合急性早幼粒细胞白血病细胞的核酸适配体探针；提供核酸适配体检测急性早幼粒细胞白血病的应用方法，为急性早幼粒细胞白血病的靶向治疗奠定方法学基础。具体步骤如下：

（1）合成随机单链DNA文库和引物

随机单链DNA文库：5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-40nt-TGG ACA CGG TGG CTT

AGT-3'