[发明专利]一种检测急性早幼粒细胞白血病适配体的筛选方法与应用

权利要求书

1.一种用于检测急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞的DNA核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID No1、No2、No3、No4、No5、No6。

2.根据权利要求1所述的用于检测急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞的DNA核酸适配体，其特征在于，所述的用于检测的标记为异硫氰酸荧光素、生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、叶酸或酶标记。

3.权利要求1所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）合成随机单链DNA文库和引物

随机单链DNA文库：

5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-40nt-TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3'

上游引物：5'-FITC-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3'

下游引物：5'-BIO-ACT AAG CCA CCG TGT CCA-3'

下游引物：5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3'

下游引物:：5'-ACT AAG CCA CCG TGT CCA-3';

（2）Cell-SELEX筛选流程

应用含有10％新生牛血清的1640培养液培养人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞（该细胞株由吉林大学赠送），当细胞数量达5x10⁶／ml后继续培养12h，离心获得沉淀，将随机单链DNA文库配制成工作液加入沉淀中（终浓度1000nM）摇匀，37℃振荡60min，洗涤去除尚未与目标细胞结合的ssDNA，恒温金属浴95℃加热10min， 12000r/min离心5min，获取上清，即为急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞的特异性核酸适配体；

（3）文库扩增

利用步骤（1）中的上、下游引物对在步骤（2）中获得的急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞的特异性核酸适配体进行PCR扩增，得到的产物为双链DNA（dsDNA）；

PCR扩增体系为1000μl: 2×Taq PCR Mix 500μl，模板400μl,上游引物40μl,下游引物40 μl, ddH₂0 20μl,扩增程序为:95℃150s，95℃30s，56.3℃30s，72 ℃30s，经过10轮循环，72℃180s；

（4）DNA单链文库的制备

利用步骤（3）中获得的dsDNA上的标记与链霉亲和素化琼脂糖微珠上链霉素的亲和作用，将dsDNA结合到磁珠表面，在磁珠中加入碱液反应后，回收得到上清液，然后加入无水乙醇，离心后获得沉淀；将沉淀溶于水中测定浓度，分装出需要的重量并制成干粉，即为急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞的特异性核酸适配体，用作下一轮筛选的ssDNA文库；

（5）重复多轮筛选

将步骤（4）收集到的ssDNA代替步骤(1)中的随机文库，重复以上步骤(2)～(4)至少12次，即得到用于检测急性早幼粒细胞白血病的核酸适配体；每轮筛选后都要进行最佳PCR条件的优化：选择最佳循环次数、模板浓度等优化的PCR条件进行大量制备dsDNA；

（6）消减筛选

以上述方式完成12轮次的正向筛选过程中，穿插2次慢性粒细胞白血病k562细胞进行消减筛选，以此达到去除与急性早幼粒细胞白血病细胞结合的非特异性寡核苷酸的目的；消减纯化的ssDNA再进行PCR扩增转变成dsDNA、纯化、亲和层析再制备成ssDNA文库；

（7）筛选后稳定性测定

为保证筛选出的核酸适配体识别急性早幼粒细胞白血病细胞的能力最强，需进行结合稳定性测定；将后几轮的筛选产物，用标记有FITC的上游引物和标记有生物素的下游引物进行PCR扩增；

PCR所得的dsDNA用链霉亲和素化琼脂糖微珠和碱的体系使其解链，收集含有FITC的链在520nm进行荧光测定；当荧光强度的增加趋于饱和，表明经过筛选后，ssDNA文库与HL-60细胞的结合稳定性达到了最大，HL-60细胞的特异性ssDNA文库即构建成功；

（8）核酸适配体的特异性检测

分别取急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞、急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞、急性单核细胞白血病U-937细胞，计数细胞数达2x10⁶/ml，离心获得细胞沉淀；将筛选获得的急性早幼粒细胞白血病的核酸适配体配制成工作液加入细胞沉淀中（终浓度1000nM）摇匀、振荡30min、洗涤去除尚未与目标细胞结合的ssDNA、收集细胞加热95℃10min后冷却、离心，收集上清，进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳；电泳结果的判断标准是：在50-100bp之间（76bp）出现条带说明核酸适配体能够与细胞结合，不出现条带的即不能结合；

结果发现：筛选获得的核酸适配体能与急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞特异性结合，电泳后有明显的条带，而与急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞、急性单核细胞白血病U-937细胞几乎没有结合。

4.权利要求1所述的核酸适配体在人急性早幼粒细胞白血病检测中应用。