[发明专利]一种核酸杂交检测方法

权利要求书

1.一种核酸杂交检测方法，其特征在于该方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、结合核酸序列、检测核酸序列、微球、信号核酸序列和信号基团实现待测目标核酸的捕获和检测：具体过程如下：

S1、根据目标核酸（3）的序列AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT，序列如SEQ ID No.1所示，设计捕获核酸序列（2）并修饰氨基：NH₂-(CH₂)₆-ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG，序列如SEQ ID No.2所示；

设计结合核酸序列（42）和检测核酸序列（43），结合核酸序列（42）和检测核酸序列（43）的核苷酸序列相同，并修饰氨基：GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT-(CH₂)₆-NH₂，序列如SEQ IDNo.3所示；结合核酸序列用于与待测目标核酸结合，检测核酸序列用于与标记了信号基团的信号核酸序列结合；.

设计信号核酸序列（51）并修饰FITC基团：AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC，序列如SEQID No.4所示；

所述基质（1）具体为氨基化的微孔板；

所述微球（41）具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球，直径100nm；

所述信号基团（52）为FITC；

S2、在氨基化的微孔板的每个孔里加入5%戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；吸出液体，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗微孔板；吸出液体，加入100μL5nmol/L的捕获核酸序列，所述捕获核酸序列的溶剂为0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，37℃反应2h；吸出液体，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗微孔板；此时，捕获核酸序列固定到氨基化的微孔板上；

S3、微孔板中每孔加入3%的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL；震荡反应lh，用磷酸缓冲液清洗；

所述预杂交液组成为：

0.5mL甲酰胺，

250μL20×SSC氯化钠-柠檬酸钠缓冲液，

100μL50×Denhards溶液，含有聚蔗糖5g、聚乙烯吡咯烷酮5g、牛血清白蛋白5g、定容至500ml，

50μL小牛胸腺DNA，

50μL PBS，lmol/L，pH7.4，

50μL乙二胺四乙酸EDTA，100mmol/L；

S4、取氨基修饰的微球30μL，0.1%固含量，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5%戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL5nmol/L的结合核酸序列和检测核酸序列，所述结合核酸序列和检测核酸序列的溶剂为0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了结合核酸序列和检测核酸序列的标记微球；

S5、将3%的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步所述的离心管；震荡反应lh，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到标记微球悬浮液；

S6、在包被好的微孔板中每孔加入100μL杂交液，根据实验目的加入5μL待测目标核酸，40℃反应30min，弃上清；捕获核酸序列和待测目标核酸结合；

S7、在微孔板上再加入100μL标记微球悬浮液，40℃反应30min，弃上清；固定在微球上的结合核酸序列和待测目标核酸结合；

S8、在微孔板上加入100μL信号核酸序列5nmol/L，40℃反应30min，弃上清；标记了信号基团的信号核酸序列和固定在微球上的检测核酸序列结合；

S9、荧光分析仪上读取结果；计算检测孔和空白对照孔的比值，如果大于1.5，则表明检测样本中存在目标核酸，如果小于1.5则表面不含目标核酸或目标核酸含量低于检测限。

2.一种核酸杂交检测方法，其特征在于该方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、结合核酸序列、检测核酸序列、微球、信号核酸序列和信号基团实现待测目标核酸的捕获和检测：具体过程如下：

S1、根据目标核酸（3）的序列AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT(SEQ ID No.1)，设计捕获核酸序列（2）并修饰氨基：NH₂-(CH₂)₆-ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG，序列如SEQ ID No.2所示；

设计结合核酸序列（42）和检测核酸序列（43），结合核酸序列（42）和检测核酸序列（43）的核苷酸序列相同，并修饰氨基：GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT-(CH₂)₆-NH₂，序列如SEQ IDNo.3所示；结合核酸序列用于与待测目标核酸结合，检测核酸序列用于与标记了信号基团的信号核酸序列结合；.

设计信号核酸序列（51）并修饰FITC基团：AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC，序列如SEQID No.4所示；

所述基质（1）具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球，直径100nm；

所述微球（41）具体为氨基修饰的聚苯乙烯微球，直径100nm；

所述信号基团（52）为FITC；

S2、取氨基修饰的微球30μL，0.1%固含量，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5%戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL 5nmol/L的捕获核酸序列，所述捕获核酸序列的溶剂为0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了捕获核酸序列的捕获微球；

S3、将3%的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步的离心管；震荡反应lh，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到捕获微球悬浮液；

所述预杂交液组成为：

0.5mL甲酰胺，

250μL20×SSC氯化钠-柠檬酸钠缓冲液，

100μL50×Denhards溶液，含有聚蔗糖5g、聚乙烯吡咯烷酮5g、牛血清白蛋白5g、定容至500ml，

50μL小牛胸腺DNA，

50μL PBS，lmol/L，pH7.4，

50μL乙二胺四乙酸EDTA，100mmol/L；

S4、取氨基修饰的微球30μL，0.1%固含量，加入0.5mL的离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入5%戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清，加入100μL5nmol/L的结合核酸序列和检测核酸序列，所述结合核酸序列和检测核酸序列的溶剂为0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液，37℃反应2h；5000rpm离心10分钟，弃上清，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗；5000rpm离心10分钟，弃上清；得到固定了结合核酸序列和检测核酸序列的标记微球；

S5、将3%的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL加入上一步的离心管；震荡反应lh，用磷酸缓冲液清洗；用杂交液300μL重新悬浮；得到标记微球悬浮液；

S6、在微孔板中每孔加入100μL捕获微球悬浮液，根据实验目的加入5μL待测目标核酸，40℃反应30min，弃上清；捕获核酸序列和待测目标核酸结合；

S7、在微孔板上再加入100μL标记微球悬浮液，40℃反应30min，弃上清；固定在微球上的结合核酸序列和待测目标核酸结合；

S8、在微孔板上加入100μL信号核酸序列5nmol/L，40℃反应30min，弃上清；标记了信号基团的信号核酸序列和固定在微球上的检测核酸序列结合；

S9、荧光分析仪上读取结果；计算检测孔和空白对照孔的比值，如果大于1.5，则表明检测样本中存在目标核酸，如果小于1.5则表面不含目标核酸或目标核酸含量低于检测限。