[发明专利]一步法实时荧光RT‑PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法，属于蔬菜病毒检测技术领域。

背景技术

植物病毒是植物的“癌症”，其流行依赖于载体的传播扩散，其中近80％的植物病毒通过特定的媒介昆虫进行传播，且以半翅目的刺吸式口器昆虫居多，例如蚜虫、粉虱、飞虱、木虱、叶蝉等。

随着全球气候变暖，以及经济贸易往来频繁，外来生物入侵加剧，植物病毒病的发生也日趋严重，由褐飞虱(Nilaparvata lugens)传播的水稻矮缩病毒病和由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播的番茄黄化曲叶病毒病在世界范围内流行。近年来一种新入侵的植物病毒，番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)传入我国内陆地区，该病毒可以侵染番茄、辣椒、甜椒、烟草等多种作物，侵入植株后，导致叶脉间发黄褪绿，边缘卷曲变脆，阻碍植株正常生长发育，造成果实减产。最新监测结果表明，ToCV在我国呈快速蔓延态势，目前已成功扩散至北京、天津、内蒙古、山东、山西和浙江等地。该病毒不能通过摩擦等方式接种，仅能够通过昆虫传播，主要介体有烟粉虱、温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)和纹翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)。

针对植物病毒，早期检测、监测和预警是重要的防治手段之一，准确、灵敏的检测手段对于开展ToCV的早期诊断具有重要的实际意义。烟粉虱作为ToCV的主要传播介体，相当于病毒的“采集器”和“注射器”，特定建立针对单头媒介昆虫的高灵敏性病毒分子检测技术体系，不仅能够实现ToCV的快速、准确、灵敏检测，避免传统植物取样方法对植株本身造成的损伤，对于病毒流行的风险性评估以及蔓延趋势早期预测同样具有一定程度的科学指导价值。目前，ToCV的分子生物学检测多采用普通PCR技术，灵敏度有限，无法满足低病毒含量样品的准确检测，而实时荧光定量PCR灵敏度高，可以满足病毒含量较低样本的检测。传统普通PCR和实时荧光定量PCR方法都需要进行RNA提取、第一链cDNA的合成、病毒检测三个阶段，耗时相对较多，无法满足大量待检样品的快速检测。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种灵敏、快速、准确的一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法。

本发明技术方案如下：

一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的一步法实时荧光RT-PCR检测引物是根据NCBI数据库中番茄褪绿病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)基因(AGN91001.1)的保守序列进行设计，并通过NCBI的Primer-BLAST进行比对，保证引物的特异性。引物序列如下：

上游引物ToCV-RqF：AACTCTCGGCACCCTGATTG；SEQ ID NO.1

下游引物ToCV-RqR：TGACCCCGTTCTCCTTTGTG；SEQ ID NO.2

一步法实时荧光PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取单头烟粉虱的总RNA；

(2)制备ToCV标准品，并按梯度稀释成不同浓度，制备标准曲线；

(3)以步骤(1)制备的单头烟粉虱的总RNA，通过一步法实时荧光RT-PCR进行ToCV的检测，结合检测得到的扩增曲线、熔解曲线判断待检样品是否含有该病毒，并根据检测得到的Ct值，代入步骤(2)制备得到的标准曲线计算待检样品所含有的病毒量。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，提取单头烟粉虱的总RNA，步骤如下：

1)取一头待检测烟粉虱，放入去除RNase的1.5mL离心管底部，将离心管置入液氮中冷冻5s后取出，用无RNase的研磨棒进行研磨，将烟粉虱研磨成粉末后，加入400～500μL Trizol(Trizol试剂购于赛默飞世尔公司)，充分震荡混匀后，室温静置10min；

2)加入80～100μL氯仿，震荡混匀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，取上清；

3)在上清液中加入200～250μL异丙醇，充分混匀后，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；