[发明专利]一步法实时荧光RT‑PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法

权利要求书

1.一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一步法实时荧光PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取单头烟粉虱的总RNA；

(2)制备ToCV标准品，并按梯度稀释成不同浓度，制备标准曲线；

(3)以步骤(1)制备的单头烟粉虱的总RNA，通过一步法实时荧光RT-PCR进行ToCV的检测，结合检测得到的扩增曲线、熔解曲线判断待检样品是否含有该病毒，并根据检测得到的Ct值，代入步骤(2)制备得到的标准曲线计算待检样品所含有的病毒量。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取单头烟粉虱的总RNA，步骤如下：

1)取一头待检测烟粉虱，放入去除RNase的1.5mL离心管底部，将离心管置入液氮中冷冻5s后取出，用无RNase的研磨棒进行研磨，将烟粉虱研磨成粉末后，加入400～500μL Trizol，充分震荡混匀后，室温静置10min；

2)加入80～100μL氯仿，震荡混匀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，取上清；

3)在上清液中加入200～250μL异丙醇，充分混匀后，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；

4)加入400～500μL体积浓度75％的乙醇溶液，充分洗涤沉淀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；

5)静置，待离心管中沉淀周围的体积浓度75％的乙醇溶液充分挥发后，加入8～10μLRNase-Free water，沉淀溶解后，即得到单头烟粉虱的总RNA。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，制备ToCV标准品和标准曲线步骤如下：

1)以ToCV感染的番茄植株cDNA作为模板，用一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游引物和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH₂O 17.25μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环；72℃后延伸10min，置于4℃保存；

2)将PCR产物经纯化后连接至pMD^TM 18-T Vector，然后转入大肠杆菌感受态细胞Trans5α，37℃过夜培养后，筛选阳性克隆，经测序正确，继续扩大培养，然后提取重组质粒，测定质粒浓度，计算出质粒浓度拷贝数，作为ToCV质粒标准品使用，计算公式如下：

C＝A/B×6.02×10¹⁴

A代表质粒浓度ng/μL，B代表质粒DNA分子量，C代表copies/μL；

3)将ToCV质粒标准品按照10倍稀释得到10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³的8个浓度梯度的质粒样品作为模板进行实时荧光PCR；仪器自动生成标准曲线，扩增效率为99％，相关系数R²＝0.991，直线方程为：

Y＝-3.34×lg(X)+44.28；

式中：Y、循环阈值(Ct值)；X、样品初始浓度。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，实时荧光PCR反应体系如下：

2×One Step SYBR RT-PCR buffer III 10μL、ExTaqHS 0.4μL、上游引物和下游引物各0.4μL、质粒样品1μL、ddH₂O 7.8μL；

实时荧光PCR反应程序为：95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。