[发明专利]一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。该基因工程菌是将来自猕猴桃(Actinidia arguta)的芳樟醇合成酶基因LIS经优化后，转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f；在此基础上同时过表达内源HMG1、IDI1或ERG中的一种或多种基因。此外，通过对该基因工程菌发酵时添加的碳源如葡萄糖、甘油、果糖、柠檬酸以及丙酮酸及其浓度进行选择，进一步提高芳樟醇的产量。芳樟醇的产量最高能达到6.96mg/L，以及单位胞内芳樟醇含量939.04μg/g细胞干重(DCW)的极高产量。该基因工程菌能用于大规模商业化生产，前景良好。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

背景技术

芳樟醇结构中含有两个类异戊二烯基和十个碳原子，因其作为精油中的芳香物质和食品添加剂以及高级生物能源而被高度关注。芳樟醇作为开环单萜叔醇，是众多精油中的主要成分之一。花香中约有70％的萜类化合物以芳樟醇为代表。芳樟醇作为芳香和风味物质被添加到洗发水、香皂、沐浴露等化妆品中和家用洗涤剂中以及加工食品和饮料中。另外，芳樟醇也是生产维生素E、微生物A、法呢醇、香茅醇和紫罗兰酮等产物的关键前体。芳樟醇还具有抗真菌、细菌和杀虫剂的特性。

当前，天然产物受到自然资源的限制产量普遍很低。作为植物的次级代谢产物，通常提取和分离都会对环境造成一定的污染并且成本很高。同时，大部分天然产物都具有几种异构体，并且结构复杂，传统的化学工艺合成可能无法满足纯度的要求。基于这些原因，利用微生物生产天然产物成为一个可行的选择，其合成途径见图1所示。一般通过外源引入芳樟醇合成酶基因生物发酵法生产芳樟醇，但目前在酿酒酵母中引入外源芳樟醇合成酶基因，其产量不高，仅为0.095mg/L(Pegah Amiri et al.,Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for linalool production,Biotechnology Letters,March2016,Volume 38,Issue 3,pp 503–508)或0.127mg/L(孙明雪等，调控酿酒酵母类异戊二烯合成途径强化芳樟醇合成，生物工程学报，2013年6月23日，29(6)：751-759)，亟需高产芳樟醇的基因工程菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏高产芳樟醇的基因工程菌的不足，提供一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

本发明提供的技术方案如下：

本发明的技术方案之一为：一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将经特殊优化的外源猕猴桃(Actinidia arguta)芳樟醇合成酶基因(LIS)转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母构建而成，所述LIS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；优选地，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Polf。

优选地，基因工程菌还转化了内源基因，其中内源基因包括HMG1、IDI1和/或ERG；IDI1为单拷贝、双拷贝或三拷贝，ERG基因为ERG8、ERG10、ERG12、ERG19或ERG20^F88W-N119W；HMG1、IDI1、ERG8、ERG10、ERG12及ERG19基因的核苷酸序列如基因库中所示；ERG20^F88W-N119W的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

根据本发明，ERG20^F88W-N119W是指ERG20基因的突变体，其在现有ERG20基因88位氨基酸F(苯丙氨酸)变为W(色氨酸)，119位氨基酸N(天冬酰胺)变为W(色氨酸)。

更优选地，内源基因为HMG1；进一步更优选地，内源基因为组合1)HMG1和IDI1、2)HMG1和ERG、或3)HMG1、IDI1和ERG；其中ERG优选ERG12或ERG20^F88W-N119W。