[发明专利]引物探针组合、PCR反应液、试剂盒及其应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测百日咳鲍特氏菌的引物探针组合/PCR反应液、试剂盒及其应用。

【背景技术】

百日咳鲍特氏杆菌(Bordetella Pertussis)是革兰氏阴性杆菌，其为百日咳的致病菌，仅对人类致病。典型的百日咳病程持续数周并可分为3期。卡他期(1-2周)：流涕，低热，鼻炎和轻微的咳嗽(婴儿可出现呼吸暂停/呼吸衰竭)。痉咳期(2-6周)：阵发性痉咳，多为干咳，继之深长吸气，发出“鸡鸣样”哮吼声和咳嗽声后呕吐。恢复期(≥2周)：咳嗽发作的频率和严重程度逐渐减轻。百日咳鲍特氏杆菌潜伏期为5-21天，平均为7天。患者从出现卡他等前驱症状至出现症状后3周有传染性。百日咳的临床诊断标准为：咳嗽≥2周并伴有以下症状之一：阵发性痉咳，吸气时“鸡鸣样”哮吼声或无其他病因的咳嗽后呕吐。鲍特氏菌属下的其他种如副百日咳鲍特氏菌(Bordetella Parapertussis)和霍氏鲍特氏菌(Bordetella holmesii)也能感染人类并导致类似百日咳的哮吼声症状。6个月以下的婴儿患百日咳多数会出现肺炎，癫痫，脑病和严重咳嗽的并发症，甚至死亡。青少年和成人由于没有典型的“鸡鸣样”哮吼常常被漏诊，从而增加了婴儿与儿童被传播感染的风险。虽然百日咳疫苗的接种被广泛推广，世界各地仍然频繁地出现百日咳爆发。这可能与百日咳疫苗的保护效力减退以及流行菌株的抗原变异有关。目前全世界每年约有48,500,000人发病，死亡人数约为295,000人。

百日咳实验室诊断的金标准是鼻咽分泌物培养。但由于细菌培养时间长,技术要求高，灵敏度低(咳嗽3周的患者仅1％-3％培养阳性)，临床未能普及。血清学方法是采用ELISA方法检测血清中的百日咳特异性抗体，灵敏度为20％-90％，可适用于免疫接种效果的监控，个体免疫状态的确定，流行病学调查。分别在急性期(起病2周内)和恢复期(起病4周后)检测血清百日咳毒素(pertussis toxin,PT)的IgG可以辅助临床表现不典型的病例的诊断，如成人和青少年。PCR技术已经广泛应用到呼吸道分泌物的病原体检查，灵敏度最高(73％-100％)。目前使用的百日咳鲍特氏菌的realtime-PCR试剂盒中引物针对的靶序列有百日咳毒素基因(PT),IS481等。但由于鲍特菌属内的不同种之间基因组同源性很高，部分试剂盒中引物和探针会非特异性地检测霍氏鲍特氏菌或支气管炎鲍特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，造成假阳性或定量结果不准确，易误导临床诊断。

因此，有必要提供一种新的技术解决上述技术问题。

【发明内容】

本发明的目的是克服上述技术问题，提供一种特异性好、灵敏度高、检测效率高的用于检测百日咳鲍特氏菌的引物探针组合。

本发明的技术方案是：

一种引物探针组合，包括用于检测百日咳鲍特氏菌的引物和用于检测百日咳鲍特氏菌的探针，所述用于检测百日咳鲍特氏菌的引物包括上游引物和下游引物，其中，

所述用于检测百日咳鲍特氏菌的上游引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述用于检测百日咳鲍特氏菌的下游引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述用于检测百日咳鲍特氏菌的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；

其中所述用于检测百日咳鲍特氏菌的探针的5＇端连接有FAM荧光基团，其3＇端连接有TAMRA淬灭基团。

本发明还提供一种PCR反应液。所述PCR反应液包括所述引物探针组合。

优选的，所述PCR反应液还包括荧光定量PCR扩增试剂、内标质粒、用于扩增内标质粒中内标片段的引物和用于检测内标片段的探针，所述用于扩增内标质粒中内标片段的引物包括内标片段上游引物和内标片段下游引物，其中，

所述内标片段上游引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；

所述内标片段下游引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；

所述用于检测内标片段的探针如序列表中SEQ ID NO.6所示；

其中，所述用于检测内标片段的探针的5＇端连接有HEX荧光基团，其3＇端连接有TAMRA淬灭基团。

优选的，所述内标片段上游引物和所述内标片段下游引物的终浓度均为0.8μM，所述用于检测内标片段的探针的终浓度为0.4μM。

优选的，所述内标质粒为以pUC57为载体的内标片段重组质粒，其终浓度为1×10³copy/ml。