[发明专利]基于变性牛血清蛋白为模板的铜纳米簇的肝素检测方法

说明书

本发明公开基于变性牛血清蛋白为模板的铜纳米簇的肝素检测方法，以磷酸缓冲水溶液、铜纳米簇分散体系和待测样品组成肝素检测体系，检测加入待测样品前后的荧光强度变化，对比标准曲线，得到待测样品中肝素的含量。本发明采用“一锅法”合成以变性的牛血清蛋白为模板的铜纳米簇，合成的材料粒径尺寸均一，荧光性能好、性质稳定，发光位置在642.04nm，属于近红外区，避免了自体荧光的干扰，可直接快速地检测肝素含量，检测线性范围宽，检出限低，在生物体系检测和临床应用等方面具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于金属纳米簇的制备及其在荧光传感方面的应用领域，具体涉及一种基于变性的牛血清蛋白为模板的铜纳米簇的水相合成方法及其采用荧光猝灭“turn off”模式免标记、高效、选择性检测肝素方面的应用。

背景技术

肝素是一种酸性粘多糖，广泛存在于哺乳动物的肝、肾、胸腺、血液中，在生理学及食品分析方面有其独特的性能，在心血管疾病及治疗凝血方面具有重要应用，如防治血栓栓塞性疾病，弥漫性血管内凝血，及体外抗凝等。在心血管手术或避免血栓形成方面，监测肝素的水平是至关重要的，因为过量的肝素会引起一些负面影响，如大出血或血小板减少，因此在手术和抗凝治疗过程中密切监测和量化血清中肝素浓度具有重要意义。由于其生物应用性和药理的重要性，灵敏、快速的测定肝素含量已经引起了人们的广泛关注，目前已有几种方法可用于肝素的检测，分别是血浆法，化学测定法，生物底色法，染料比色法。但由于其检测步骤的复杂性、检测纯度的较高要求、检测价格昂贵等苛刻的条件均限制了这些方法的应用。目前，利用荧光分光光度法检测肝素的报道还相对较少，众所周知，荧光检测法灵敏、简单、价格低廉，具有较低的检出限。传统的纳米材料如量子点和金属纳米簇作为荧光探针均得到了很好的应用，然而，量子点中重金属的存在使得其安全性和生物相容性还有待商榷，进而使其在生物检测方面受到限制。金属纳米簇由于其具有独特的荧光性质，无毒性，尺寸较小且均匀，水溶性好等优点使得其相比于量子点在生物检测方面有更好的应用性。

过去几十年，纳米技术的快速发展催生了各种金属纳米材料，金属纳米簇更因其超小尺寸、低毒性、高荧光量子产率、良好的稳定性已经引起了国内外学者的广泛关注。随着一段时间的发展，金、银纳米簇的合成及应用已逐渐变得成熟，但因其昂贵的前驱限制了其发展，而铜纳米簇更因其制备成本低、原料易得、工业应用更广泛、与金银相似的性能等优点在生物传感、生物成像、蛋白检测等方面具有很好的应用前景。因此，相比于贵金属纳米簇，铜纳米簇在复杂的应用中具有更好的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供基于变性牛血清蛋白为模板的铜纳米簇的肝素检测方法,以变性的牛血清蛋白为模板水相合成了一种具有独特荧光性能的铜纳米簇，采用荧光猝灭“turn off”模式实现了对肝素免标记、高效、选择性的检测。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：

基于变性牛血清蛋白为模板的铜纳米簇的肝素检测方法，以磷酸缓冲水溶液(PBS)、铜纳米簇分散体系和待测样品组成肝素检测体系，检测加入待测样品前后的荧光强度变化，对比标准曲线，得到待测样品中肝素的含量，线性方程为ΔF＝164.66798+0.49882x，ΔF为加入待测样品前后的荧光强度变化值，x为肝素浓度。

在上述技术方案中，线性范围为2.5ng/mL～250ng/mL，检出限是0.64ng/mL，选择642.02nm处荧光强度进行检测。

在上述技术方案中，待测样品中肝素与铜纳米簇充分作用，使得荧光发生猝灭并检测荧光发射光谱，通过荧光发射光谱强度的变化值证明该铜纳米簇检测肝素的可行性，即待测样品中存在肝素，则荧光发生淬灭，强度下降。

在上述技术方案中，磷酸缓冲水溶液(PBS)浓度为10nmol/L，25℃，pH＝7.4。

在上述技术方案中，肝素检测体系由2.4mL磷酸缓冲水溶液、铜纳米簇分散体系1.5mL和100μL待测样品组成。