[发明专利]基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜与方法

说明书

本发明基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜与方法属于光学宽场显微成像领域，该装置由基于锥反射镜的环形平行光束发生光路、基于椭球反射镜的照明光路和普通荧光显微成像光路组成，该方法通过调整两互补锥反射镜间距离，实现样品激发深度的改变；本发明利用椭球反射镜的回转特性，提供了对样品的全方位角无阴影照明，消除了常规方案中单向照明带来的“灯塔”状瑕疵，提高了成像质量；利用椭球反射镜大数值孔径的特点，提供了对样品照明入射角从全反射临界角到近90度大范围精细可调的全内反射照明，满足了逐渐兴起的TIRF轴向超分辨三维成像研究对样品激发深度精密可调的需求；最终使得TIRF成像质量和轴向分辨率得到大幅提高。

技术领域

本发明基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜属于光学宽场显微成像领域和光学TIRF成像技术领域，可广泛适用于生命科学、物理化学和材料科学等领域的研究。

背景技术

TIRF显微镜利用光线全反射后在介质交界面附近产生的倏逝波来激发样品荧光，由于倏逝波的强度沿垂直界面方向上呈指数衰减，故只有靠近界面附近几百纳米的一小薄层样品区域能够被激发，极大地降低了背景光噪声的干扰，因此该技术被广泛地应用于要求高信噪比的技术领域尤其适合研究细胞膜或者膜内附近区域单分子的动态成像过程，如生物单分子研究、细胞信号转导动力学过程的研究等

现有技术方案主要有棱镜型TIRF和基于大NA物镜型TIRF两种。其中前者为早期发展起来的技术，具有结构简单、成本较低、入射角容易控制等优点，但对样品的观察操作比较复杂，目前并未形成成熟的商品型号；而后者是为了便于使用者的操作所做的改进型，虽然其有着光路结构比较复杂、成本较高且入射角难于控制等缺点，但鉴于其装置结构紧凑易于集成到现有显微镜平台、观察操作方便的优点，受到广大用户的热烈欢迎，从而得到迅速发展，目前已具有相关的成熟商品机型。然而，由于该两种技术的商品型方案采用的都是单向照明的方法，都存在着照明阴影带来的成像质量的下降的问题。在单方向照明的情况下，由于激光器光源的相干性通常会产生干涉条纹、灯塔型拖尾等影响照明均匀性的瑕疵，这些瑕疵将较大程度的影响TIRF成像质量，甚至引起对样品成像的失真。为了解决该问题，A.L.Mattheyses在物镜型TIRF中加入一个光楔，并利用光楔的旋转产生一个时间域上的空心照明光锥，通过将各个照明方向下CCD采集到的图像的进行叠加平均，从而良好地抑制了单向照明的带来的问题。雷明通过在物镜型TIRF中引入W型反射镜，在物镜的后焦面产生环形光束，从而利用物镜生成空间域上的空心照明光锥，通过各方向照明的叠加来抑制单向照明的阴影问题。陆续被提出的一些抑制单向照明阴影的方法都是基于这两种原理的，并且都是基于物镜型TIRF方案的改进。

随着TIRF技术的发展并受到日益广泛的关注，众多学者已经开始尝试利用TIRF技术进行轴向超分辨的三维成像的研究，如利用荧光漂白的方法、基于概率重构的方法等。该类研究需要对倏逝波穿透深度精确可调，即要求照明光入射角的范围可调，且可调范围越大越好。然而现有装置大部分都是基于物镜型TIRF的，一方面照明光的入射角范围受物镜结构的限制，最大不超过78度，另一方面由于需要调整照明光入射角，装置结构比较复杂，故采用的方案都为单向照明，此时便引入了照明阴影带来的瑕疵，而且现有调整照明光入射角的结构成本高昂，如使用了扫描振镜系统、声光调制系统等。这些不利因素都不利于良好的TIRF成像效果及相关技术的研究发展。

发明内容

在光学TIRF显微成像技术领域中，针对通常技术手段中存在照明阴影影响成像质量的缺陷和实际应用中需要样品激发深度精密可调的需求，本发明公开了一种基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜与方法，利用椭球反射镜的回转特性，提供了对样品的全方位角无阴影照明，消除了通常技术方案中单向照明带来的“灯塔”状瑕疵，极大的提高了成像质量；利用椭球反射镜大数值孔径的特点，提供了对样品照明入射角从全反射临界角到近90度大范围精细可调的全内反射照明，完美满足了现状中逐渐兴起的TIRF轴向超分辨三维成像研究对样品激发深度精密可调的需求；最终使得TIRF成像质量和轴向分辨率得到大幅提高。

本发明的目的是这样实现的：