[发明专利]基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜与方法

权利要求书

1.一种基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜，其特征在于，由同轴配置的环形平行光束发生光路、照明光路和成像光路组成；

所述的环形平行光束发生光路由依次同轴设置的激光器(1)、孔径光阑(2)、凹型锥面反射镜(3)和凸型锥面反射镜(4)组成，所述凹型锥面反射镜(3)和所述凸型锥面反射镜(4)的间距能够调整；凹型锥面反射镜(3)和凸型锥面反射镜(4)具有相同的锥顶角；

所述的照明光路由依次同轴设置的聚光透镜(5)、椭球反射镜(6)、半球透镜(7)和光学平板(8)组成，所述聚光透镜(5)的后焦点与所述椭球反射镜(6)的远焦点重合，所述半球透镜(7)的球心与所述椭球反射镜(6)的近焦点重合，半球透镜(7)的球面朝向椭球反射镜(6)，光学平板(8)前端面与半球透镜(7)端面用胶紧贴粘合，光学平板(8)的折射率不大于胶的折射率，胶的折射率不大于半球透镜(7)的折射率，半球透镜(7)的球心位于光学平板(8)的后端面；

所述的成像光路由依次同轴设置的成像物镜(10)、滤光片(11)、管镜(12)和图像探测器(13)组成；所述成像物镜(10)的前焦点与椭球反射镜(6)的近焦点重合。

2.一种在权利要求1所述基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜上实现的穿透深度可调TIRF显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a、将样品(9)密封于下盖玻片和上盖玻片之间，所述下盖玻片的折射率不低于光学平板(8)的折射率；

步骤b、将样品(9)、下盖玻片、油和上盖玻片作为整体，紧贴于光学平板(8)的后端面，且所述下盖玻片与光学平板(8)之间涂有折射率匹配液，所述折射率匹配液的折射率不低于光学平板(8)的折射率；

步骤c、开启激光器(1)，将孔径光阑(2)开到最大，将凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距调到最大，调整成像物镜(10)与样品(9)间的距离，使得图像探测器(13)对样品(9)成像；

步骤d、根据视场要求，将孔径光阑(2)调小，根据对图像探测器(13)采集到的图像强度要求，增大激光器(1)光强，然后逐渐减小凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距，得到穿透深度逐渐减小的TIRF图像；

步骤e、根据凸型锥面反射镜(4)、凹型锥面反射镜(3)、聚光透镜(5)和椭球反射镜(6)的参数，建立凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距与倏逝波穿透深度函数关系数表，即间距与穿透深度关系数表；

步骤f、根据间距与穿透深度关系数表，找到所需要的倏逝波穿透深度对应的凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距值；

步骤g、将凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距调整到步骤f得到的间距值，利用图像探测器(13)采集此时的荧光图像，得到所需穿透深度下的TIRF图像。

3.根据权利要求2所述的穿透深度可调TIRF显微成像方法，其特征在于，所述步骤e所述的间距与穿透深度关系数表的建立步骤，具体为：

步骤e1、按照如下公式，由所需穿透深度d_depth计算出所需入射角θ：

其中，λ为波长，n₂₁为样品(9)折射率和下盖玻片折射率的比值；

步骤e2、根据所需入射角θ、椭球反射镜(6)的离心率参数e和所需会聚光锥的会聚角之间的关系，计算出的所需会聚光锥的会聚角值：

步骤e3、按照如下公式，由所需会聚光锥的会聚角计算出所需凹型锥面反射镜(3)和凸型锥面反射镜(4)的反射面距离d：

其中，α为凹型锥面反射镜(3)和凸型锥面反射镜(4)的顶角，f为聚光透镜(5)的焦距，进而得到间距与穿透深度关系；

步骤e4、选取不同的穿透深度d_depth，重复步骤d1至步骤d3，完成间距与穿透深度关系数表的建立。