[发明专利]分离纯化Salsolinol合成酶的方法

说明书

分离纯化Salsolinol合成酶的方法，属于蛋白纯化领域。采用高氯酸沉淀法对Salsolinol合成酶的粗酶液进行预处理；将经过高氯酸处理的Salsolinol合成酶的粗酶液中加入K₂CO₃，于‑80℃放置一段时间如15分钟后取出，离心，取上清液；对所得上清液进行超滤，至少包括采用截留分子量3kD的超滤管，对超滤后的滤液采用亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶。采用本发明方程能完全纯化Salsolinol合成酶。

技术领域

本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及分离纯化Salsolinol合成酶的方法。

背景技术

Sal合成酶(Salsolinol synthase)是儿茶酚异喹啉类物质合成代谢过程中的首个关键酶，它是一种催化多巴胺(DA)和乙醛(AcH)生成多巴胺能神经毒性物质Salsolinol的酶，直接影响到Sal及其衍生物在体内的代谢过程，是帕金森病的重要内源性致病因子与其致病密切相关。迄今为止，关于Sal合成酶的研究报道甚少，仅有少数研究人员对其性质做了部分研究工作，但其具体性质仍不清楚。目前推测Sal合成酶可能是一种能催化内源性神经毒素生成的新酶，但它尚未获得分离纯化，更无酶活检测、酶学性质方面的系统研究。

发明内容

Sal合成酶是一种至今为止尚未获得分离纯化的蛋白质，对其酶学性质知之甚少，研究显示Sal合成酶具有的分子量小、极性较强等特点。基于此，本发明建立一套基于酸沉淀法、超滤法和亲水色谱(HILIC)法等技术的专门针对Sal合成酶的分离纯化新方法，它具有操作简便、回收率高等优点。

分离纯化Salsolinol合成酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用高氯酸沉淀法对Salsolinol合成酶的粗酶液进行预处理；

(2)将步骤(1)经过高氯酸处理的Salsolinol合成酶的粗酶液中加入K₂CO₃，于-80℃放置一段时间如15分钟后取出，离心，取上清液；

(3)对步骤(2)所得上清液进行超滤，至少包括采用截留分子量3kD的超滤管；进一步还包括在采用截留分子量3kD的超滤管之前，采用截留分子量大于3kD如100kD的超滤管进行超滤；

(4)对步骤(3)超滤后的滤液采用亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶；

进一步优选进行两次亲水色谱(HILIC)分离纯化方法；主要采用硅胶、氰基或氨基等色谱柱，采用乙腈水溶液作为流动相或洗脱，乙腈的体积百分含量为50-95％，按照乙腈比例从高到低依次洗脱；

进一步优选，还包括在采用亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶之后再通过电泳方法进一步分离纯化分子量相对更小的Sal合成酶。电泳方法采用Tris-Tricine SDS-PAGE进行分离。

进一步优选，步骤(1)采用高氯酸溶液，高氯酸溶液中还含有偏亚硫酸钠和EDTA，进一步优选1M高氯酸、10mM偏亚硫酸钠和10mM EDTA，高氯酸溶液与Salsolinol合成酶的粗酶液的体积比为1:5；

进一步优选步骤(2)中K₂CO₃的摩尔数是步骤(1)中高氯酸的0.5倍；