[发明专利]检测NUP214‑ABL1基因相对表达量的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于疾病基因检测的领域，特别是涉及采用探针实时荧光PCR技术对人类急性T淋巴细胞白血病中NUP214-ABL1的表达量进行检测的试剂盒和方法。

技术背景

急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)是一种以T淋巴细胞恶性克隆性增殖为特征的血液系统肿瘤，发病率占急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)的25％左右。T-ALL好发于儿童和青壮年，患者以外周血白细胞计数异常增高、原始细胞比例升高为主要特征，易发生T淋巴细胞骨髓浸润、胸膜渗出、中枢神经系统浸润及纵膈肿瘤等并发症，病情凶险，预后欠佳。

以往研究发现50％以上的T-ALL患者可检出核型异常，细胞遗传学检测已成为T-ALL重要的诊断指标。随着荧光原位杂交(FISH)、荧光定量PCR等分子生物学技术在临床诊断中的广泛应用，人们认识到T-ALL患者的预后与染色体易位、缺失、基因突变等细胞和分子遗传学改变密切相关。近年来研究发现，T-ALL患者中可发生NUP214-ABL1基因融合，发生率约6％，包括成人和儿童T-ALL，大多数患者治疗效果不好，预后差。根据文献报道，伴NUP214-ABL1融合基因阳性的T-ALL患者，其融合蛋白具有酪氨酸激酶活性，可促进T淋巴细胞的增殖和凋亡，对TKIs治疗敏感，TKIs治疗在一定程度上可改善该类患者的疗效和预后。检测T-ALL患者体内NUP214-ABL1融合基因的表达可为TKIs的治疗提供参考和依据，有助于T-ALL个体化治疗方案的选择和制定。

目前临床上已经将NUP214-ABL1融合基因作为一种T-ALL个体化治疗方案的选择和制定依据。NUP214-ABL1融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RQ-PCR等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足NUP214-ABL1融合基因的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于NUP214-ABL1的基因检测。

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用实时荧光PCR技术检测NUP214-ABL1融合基因。通过调整引物、探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

本发明提供了一种检测NUP214-ABL1融合基因相对表达量的引物和探针，。

进一步的，所述引物和探针还包括扩增ABL内参基因的引物和探针。

本发明还提供了一种检测NUP214-ABL1基因相对表达量的试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括用于扩增NUP214-ABL1融合基因的引物和探针

进一步的，所述试剂盒还包括扩增ABL内参基因的引物和探针。

进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照品和空白对照品。

本发明还提供了一种NUP214-ABL1融合基因相对表达量的方法，包括以下步骤：

(1)提取样本中的RNA；

(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA，并将所产生的cDNA加入到反应管中；

(3)加入检测内参基因Abl的上游引物Abl-F、下游引物Abl-R和探针Abl-Probe；

(4)加入检测所述融合基因的上游引物、下游引物和探针；

(5)进行PCR扩增反应；

(6)计算所述融合基因的相对表达量，

进一步的，所述方法还包括所述Abl内参基因的引物和探针，

所述扩增融合基因的引物和探针分别为：

NUP214-ABL1(ex23)-F：AGCACTCAGGCGGCAGAT；

NUP214-ABL1(ex29)-F：ACCACAACAGCAGCAACCTC；

NUP214-ABL1(ex31)-F：CAGTCAGGATGCAGCCAACA；